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はじめまして。農学系を専攻しております大学院生です。

現在ヒト白血病由来HL-60細胞を用いてアポトーシス関連
シグナルタンパク質の発現をウェスタンブロット法にて調べています。

浮遊細胞なので、培養液ごと回収し遠心分離にて細胞を採集するのですが、その際生きてる細胞に加え、アポトーシス小体も同時に回収したほうがよいのでしょうか?アポトーシスに至るまでのシグナルタンパク質(カスパーゼ、Bclファミリー、MAPKなど)の発現を確認したいので、アポトーシス小体などは回収せず、生きている細胞のみを回収したほうがよいと考えているのですが…。ちなみに1000rpm、3分間遠心分離し細胞を回収しています。

マニアックな質問で申し訳ないのですが、どなたか詳しい方、また似たような実験を行っている方、御教授いただければと思います。

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A 回答 (1件)

昔のことなのでうる覚えですが。



生細胞だけの分離にはフィコールに細胞の溶解液を重層
させ、2500~3000回転で遠心してました。
遠心後、中間層に来るのが生細胞だったと思います。
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Q細胞固定溶液について

細胞の固定にパラホルムアルデヒドを
使おうと考えております。
粉末はあるので溶液にしようとしているのですが
文献、サイトによって異なります。
例えば、蒸留水にパラホルムアルデヒドをいれ温める際の
時間や温度が異なります。あまり大差ないのでしょうか?
また作成したパラホルムアルデヒドはオートクレーブで
滅菌可能なのでしょうか?

Aベストアンサー

方法はどうであれ、「沸騰しない程度」に「溶けるまで」加熱すれば良いです。オートクレーブはかけてはいけません。フォルムアルデヒドは固定剤、防腐剤ですから、腐りませんし酵素などがコンタミしても不活性化するので必要ありません。むしろ、分解、有害ガスの発生が起こる危険性があります。

メーカー、グレードによって程度は違いますが、パラフォルムアルデヒド(PFA)は、水に溶かすと酸性に寄ります。これをNaOHで中性付近にしてやらないと、加熱しても溶けません。
私は、以下のようにして8%、10%、または20%のストック水溶液を調製します。
1)作る体積の10倍程度のフラスコに、出来上がり体積の位置のしるしをつけておく。
2)PFAを計量し、三角フラスコに入れる(粉末を吸わないように。マスク、ゴーグル着用が望ましい)。
3)純水をしるしのところまで入れる。
4)10NのNaOHを少量入れる(1g PFAに対し、10-20 microL程度)。
5)ドラフト内で、軽くゆすりながらバーナーで加熱する。時々火から離し、沸騰ないように加減して。
6)しばらく様子をみて、溶け残りがあるようだったら、少量ずつ10NのNaOHを加えて続行する(入れすぎ注意)。完全には溶けきらないかもしれません。全体が透きとおったら、少々顆粒が残っていてもかまいません。
7)しるしにあわせて蒸発分の純水を補う。pHペーパーでpHを確認。おおよそpH8.5を超えていないように。
8)ろ紙でろ過し、4度で保存。有効期限はおおむね一週間(フレッシュなのを使うのが原則)。

方法はどうであれ、「沸騰しない程度」に「溶けるまで」加熱すれば良いです。オートクレーブはかけてはいけません。フォルムアルデヒドは固定剤、防腐剤ですから、腐りませんし酵素などがコンタミしても不活性化するので必要ありません。むしろ、分解、有害ガスの発生が起こる危険性があります。

メーカー、グレードによって程度は違いますが、パラフォルムアルデヒド(PFA)は、水に溶かすと酸性に寄ります。これをNaOHで中性付近にしてやらないと、加熱しても溶けません。
私は、以下のようにして8%、10...続きを読む


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