接着細胞をはがして遠心するとペレットになり再分散できません。対処法をご教授ください。

体性幹細胞をベータ細胞に分化させようとしていますが、最後に確認のためのアッセイを浮遊状態で行うために、PBS(Ca/Mg -)洗浄後、トリプシン処理して、220G 5min 遠心したところ、ふわふわしたペレットになりピペッティングでも再分散できません。
これは細胞が死んでしまったのでしょうか？
対処法をご教授ください。

No.2 ベストアンサー 回答者： otx 回答日時： 2008/04/08 09:30

いろいろ検討することがあるのではないでしょうか？

トリプシンの処理時間
もともと細胞膜表面のタンパク質を壊して細胞をはがすのですから、
やりすぎると細胞自体が溶けることが容易に想像されると思いますが。

遠心力
遠心力が強すぎると細胞がつぶれることがあると容易に想像されると思います。細胞が沈めばいいのですから、遠心力を自分で変えてみることくらい簡単だと思います。

細胞の状態をチェック
細胞が死んでいるとすれば、どのステップで死んでいるのか。
トリパンブルーで染めて顕微鏡で見てみたりすれば、
どのステップで細胞にダメージがあるのか一目瞭然だと思いますが。

あと、回答へのお礼を見て思ったのですが、
トリプシン処理後、最終的に血清が入っている培地であればトリプシンを無視できるというのは、
細胞はがしに使うトリプシンの量は少ないため、
血清というタンパク質溶液があればタンパク質の濃度が濃くなるので、
細胞にダメージがいかないという意味ですけど、理解されているのでしょうか？

質問されることを否定はしませんが、まず実際にモノを見ている質問者様自身でできることがたくさんあると思います。

この回答へのお礼

詳細な説明ありがとうございます。

トリプシン処理については、分化前と同条件で行ったのですが、分化後のトリプシンの条件検討はしていませんでした。条件検討をしたいと思います。分化に時間がかかるので手痛い失敗です。

お礼日時：2008/04/08 13:43

No.1 回答者： ga111 回答日時： 2008/04/08 07:32

そのタイプの（体性幹）細胞は使ったことありませんが、トリプシンを作用させて、まだくっついているうちにトリプシンを除いてしまったらどうですか？

またトリプシンの持ち込みは、血清のある培地では、無視できることが多いですから、遠心しないで使うとか。

この回答へのお礼

ありがとうございます。
トリプシンの早めの除去は試してみたいと思います。

遠心しないのは思いつきませんでした。アッセイは無血清ですが、Ca/Mg は入ってるので無視して実験はありかもしれません。
他の方法でだめならやってみようと思います。

お礼日時：2008/04/08 08:00