痔になりやすい生活習慣とは?

滅菌水に溶かしてあるプライマーやプラスミドなどのDNAを室温で四日間放置してしまいました。箱に入った状態です。
もうこのDNAを使うのは危険でしょうか?
DNAが大丈夫かどうか確認する方法として、プラスミドは制限酵素でカットして電気泳動すれば十分でしょうか?
プライマーは数サンプルをシークエンスに使って確認することを考えています。

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A 回答 (1件)

用途や濃度(極端に低いと分解しやすい)・純度(DNaseのコンタミの程度)、溶媒(純水でなく適当なバッファーの方が安定)によると思いますが、


その程度では、実用上、問題になるほどの劣化は起こっていないでしょう。
日常的には、冷凍あるいは冷蔵で長期間保存したものや、凍結融解を繰り返したものなどを、一応大丈夫と思って使うと思いますが、室温で数日おいたものとどちらが信頼できるかといえば、微妙なところだと思います。

プラスミドは切らずにそのまま泳動して、ccc (スーパーコイル)の割合がどれくらいあるかを見た方が品質がわかると思います。プラスミドの劣化は、はまずニックが入ってOC (open circular)になり、ニックが多数できるとdouble strand breakが生じてlinearが出てきます。もっと分解が進むと低分子量のsmearが出てきます。

cccが減りOCが増えた程度なら、PCRや二次クローニングなど大抵の目的には十分です(in vitro transcription、シークエンスなどではnickの入った鋳型は問題になります)。

プライマーはシークエンスできれいな波形がでるならOKでしょう。分解されたプライマー(あるいは品質の悪いプライマー)だと、長さの異なるプライマーが混在するため、複数のピークが重なった波形になります。

プラスミドにせよプライマーにせよ、純水で溶解するのは保存性の上でよくありません。
DNAのストック溶液は、TE、あるいはEDTAを入れたくなければ薄い10 mMのTrisバッファー(pH 8程度)にしたほうがいいです。
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この回答へのお礼

なるほど、確かにそう考えると切らない方がわかりやすいですね。
ついている先生が基本的に滅菌水でいいとおっしゃっていたので私も使っていましたが、やはりTEのがいいですよね。こういうこともありますし(たぶん私だけですが・・・)

わかりやすい、すばやい回答ありがとうございます。
勉強になりましたし、心配だったので気がだいぶ楽になりました。
では確認してみます。

ありがとうございました。

お礼日時:2008/05/06 00:37

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Aベストアンサー

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プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。

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また、おおよそ10 kb以下の小さなプラスミドならVortexを使ってもかまいません。

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