今まで、環状のプラスミドDNAで形質転換を行っていましたが、
制限酵素で切断処理(切断部位は一つ)で処理したものを使ってみると
ぜんぜん上手くいきません。

物理的な大きさ増すことで形質転換効率は恐らく低下すると思うのですが、
実際にはどの位変化するものなのでしょうか?
(もちろん形質転換法によって違いはあるとは思いますけれど・・・)

今まで一回も成功した事がないのですが、いくらなんでも、
直鎖状だと形質転換できないなんて事はないですよね。

ま、腕もかなり悪いので、、、、(^^;)

A 回答 (2件)

了解しました。



バチルスは扱ったことがありませんのでなんともいえません。

既にご存知かも知れませんが、バチルス形質転換に関することがかかれた書籍が引っかかりました。参考になりますか?

参考URL:http://www.bcasj.or.jp/jssp/f_biochem/kumikae_dn …
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この回答へのお礼

わざわざ、補足どうもです。

返事が遅くなって申し訳ありませんでした。

akiyamaharukaさん、どうもありがとうございました。

しかし、あれから色々調べたのですが、、、、う~ん。
いまだにすっきりしませんね。(ーー)

まだ、ご紹介の本、手に入れてないですし、、、、(^^;)スミマセン

お礼日時:2001/06/18 23:07

申し訳ありません。

もう少し具体的なことを書いて頂けるとアドバイスしやすいのですけど。

今の情報での解答では、大きくなったベクターはトランスフォーメーション効率は下がりますがそんなに劇的に下がるものではないです。具体的な数字はごめんなさい。そんなに大きな断片を入れることはないですよね。入れるプラスミドの量を増やすことで十分対応出来ます。

直鎖状とはどういう意味なのでしょう?

この回答への補足

分かり難くて、ごめんなさい。

形質転換に使っているのは、
『環状プラスミドを、そのプラスミドをただ一箇所で切る制限酵素で、
 切断してできた、産物』です。

環状プラスミドに1つ切れ目を入れて、結果、できた直鎖上DNAで
形質転換を行ないたいのです。

ちなみに、環状のまま(制限酵素で切れ目を入れないもの)だと
ちゃんと形質転換は上手くいきます。

直鎖上にする理由は、相同組換えのためです。
環状のままだとそれが、上手く起りにくいらしいのです。
ちなみに使っているのは枯草菌です。

どうですか?
少しは、分かり易くなったでしょうか?

補足日時:2001/02/14 20:48
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Formamideを使うと、低い温度でハイブリができるので、目的に応じて、ターゲットを高温にさらしたくないとき、あるいは全くの実験者の好みで、DNA/RNA ブロットハイブリやin situ ハイブリのとき使われます。

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おそらく、
>50%Formamide,10mMリン酸バッファーpH7.0
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>100mM KCl,100mM Tris-HClpH7.4,2mM MgCl2
これは、ほとんどTaq polのバッファーですね。
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普通のpBベクターをコンピテントセルに取り込ませ、L-Ampプレート上に植菌したもの(A)と、XhoIで処理した16srRNA(PCR増幅分)を挿入した組み換えpBベクターをコンピテントセルに取り込ませ、L-Amp・IPTG・X-galプレート上に植菌しました。
形質転換効率が低下する理由はなんなんでしょうか?

Aベストアンサー

つまり
A:空ベクター
B:インサート入りベクター
ですよね。

MIYDさんの補足みたいになりますが(しかも勝手に)
コロニー総数の話から。

・ライゲーション効率
配列を挿入する際にベクターとインサートを一つの制限酵素で切断しましたよね?ライゲーションでこれをそれぞれくっつけるわけですが、ここで
1:くっついてないやつ
2:ベクターがそのまま元の形に戻ったやつ
3:インサートが入ってくっついたやつ
が生じます。

1の場合取り込まれません。分解されます。この分のコロニー数が減ります。
因みに2の場合、カラーセレクションにおいては青コロニーです。ハズレ。で、3が成功ですね。白コロニー。

ここにおいて実は形質転換効率とコロニー形成数はイコールではありませんが、それは最後に。

・大きくなるって
ベクターの一箇所を切断して、そこに配列を挿入しましたよね?5両編成の列車の三つ目と四つ目の間に貨物列車を入れたら、列車全体でみたら長くなりますね?塩基が長くなること=サイズが大きくなると考えてください。ベクターのようなプラスミドだと、塩基が長くなるほど円周が大きくなって、円が大きくなりますね。

・大きさ
プラスミドDNA濃度を何で測ってるか分かりませんが、分光光度計で測ると3kbpと7kbpのプラスミドは同じ数存在しても、濃度は7kbpの方が多く計測されます。よって同じgで揃えても、プラスミド数は異なります。で、最初と同じ理由。取り込める状態のベクター数が少ない。
また、小さいプラスミドの方が大腸菌は取り込みやすいです。大腸菌の菌株との相性もあります。


最後に、形質転換効率とは、通常、同濃度の同じプラスミドの取り込み能(コンピテンシー)を異なる大腸菌(コンピテントセル)間で比較するものであって、プラスミド間で比較するものではありません。
ぶっちゃけると同じ用に作って分注した大腸菌なら形質転換効率は「同じ」です。今回は他の条件が変わったのでした。

こんなかんじで。

つまり
A:空ベクター
B:インサート入りベクター
ですよね。

MIYDさんの補足みたいになりますが(しかも勝手に)
コロニー総数の話から。

・ライゲーション効率
配列を挿入する際にベクターとインサートを一つの制限酵素で切断しましたよね?ライゲーションでこれをそれぞれくっつけるわけですが、ここで
1:くっついてないやつ
2:ベクターがそのまま元の形に戻ったやつ
3:インサートが入ってくっついたやつ
が生じます。

1の場合取り込まれません。分解されます。この分のコロニー数が...続きを読む

Q粉体のDNAを溶かす

こんにちは。
最近DNAの実験を始めたものです。

とても初歩的な質問なのですが、粉体のDNAを液体に溶かすとき、超純水やバッファーなど溶媒によるちがいってあるのでしょうか?
現在、私は超純水に溶かしてそれを冷蔵庫で保存しているのですが、時間が経ったらDNAの質が変わってしまったり、ということはありますか?また、その溶液を使用する前にはボルテックスしたほうがよいのでしょうか?

Aベストアンサー

♯1です。

>冷蔵庫での保存は短時間です。といっても、保存期間はだいたい2週間くらいなのですが(実験している先輩は3ヶ月は大丈夫と言っていましたので)

3ヶ月は大丈夫??
なにをもって大丈夫と判断しているのでしょう?
私には怖くてできませんね。
少しは分解したりしているかもしれませんよ。
そんなものを試料には使いたくないですね。
そこからクローニングしたり、遺伝子を読んだりしても
分解していたら意味ありませんから。

私が考える短時間はこの場合せいぜい1日(その日のうちに使うという意味で実質半日)です。
-20度で冷凍保存です(量が多かったり、よく使うものはいくつかに分けた上で)。
使うときは氷中で解凍です(しばらく常温においてある程度溶けてから氷中に移すときもありますが)。
量が少なければ大して時間はかかりません。
実験は正確さが第一です。
どんなに早くても不正確ではそのデータを最終的に使うことはできません(予備試験ならある程度ラフでも構いませんけど)。
なお、先輩が言うことはすべて正しいわけではありません。
自分なりに調べるなりすることが大事です。
ちなみに
実験関係の参考書としては
イラストレイティッドシリーズが大変わかりやすいです。
出版社などは忘れましたが図解も多く、説明も1ステップずつ丁寧に書いてあります。
すくなくともタンパクの精製と遺伝子関係の2種は確実にあります。
そのほかにもあるかもしれません。

>容器と溶媒はオートクレーブではなく、UV照射で滅菌していますが、だめでしょうか?

UVで溶液の中まで滅菌できるとは思えません。
例え水中にUVランプを入れてもです。
殺菌にはなっても滅菌レベルは難しいでしょう。
オートクレーブが確実です。
オートクレーブができない理由があれば別ですがUVでは不安です。
第一酵素は失活しないのでそういう意味でもやる意義が低いです。
容器に関してはUVでも可能な気もしますが市販の滅菌容器はガンマ線滅菌だったと思います。他になにか酸化力のあるガス(エチレンオキサイドだったかな)も使っていたものもあったような気がします。やはり心もとないです。オートクレーブすべきです。

♯1です。

>冷蔵庫での保存は短時間です。といっても、保存期間はだいたい2週間くらいなのですが(実験している先輩は3ヶ月は大丈夫と言っていましたので)

3ヶ月は大丈夫??
なにをもって大丈夫と判断しているのでしょう?
私には怖くてできませんね。
少しは分解したりしているかもしれませんよ。
そんなものを試料には使いたくないですね。
そこからクローニングしたり、遺伝子を読んだりしても
分解していたら意味ありませんから。

私が考える短時間はこの場合せいぜい1日(その日のうちに使...続きを読む

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む


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