【最大10000ポイント】当たる!!質問投稿キャンペーン!

わたしは今pET15-bへのサブクローニングを行っていますが、なかなかうまくいきません。そこで質問なんですが、pETベクターにはそもそも遺伝子が入りにくいものなんでしょうか。また何かうまくいくコツみたいなものがあれば教えてください。

このQ&Aに関連する最新のQ&A

A 回答 (2件)

>pETベクターにはそもそも遺伝子が入りにくいものなんでしょうか。



そんなことはありません。

あと、うまくいかない理由で考えられることは山ほどありますが
他の理由を考えたほうがいいと思います。
    • good
    • 0

ほかのベクターに比べて入りにくい(ligationしにくい)ということはないですが、大腸菌に入れたときに大腸菌が増えにくいということはあります。

そのためにコロニーが生えてこないのではないでしょうか。

大腸菌が増えにくいのは、外来遺伝子からタンパク質が発現してしまい、それが大腸菌にたいして毒性を示すことがあるからです。

宿主菌はなにを使っていますか? 大量発現の時に使うBL21(DE3)だと誘導をかけなくてもleakyに発現して、大腸菌が死んでしまうことがあるのでサブクローニングには不適です。まず、DH5などpET15からの発現に必要な遺伝子(T7 polymerase)を持たない系統でサブクローニングして、当たりのプラスミドを精製してBL21(DE3)に入れなおすといいでしょう。
    • good
    • 0
この回答へのお礼

有難うございます。発現株はBL21(DE3)を使っています。大変参考になりました。また何かありましたら宜しくお願いします。

お礼日時:2008/07/22 15:04

このQ&Aに関連する人気のQ&A

お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!


人気Q&Aランキング