ネットが遅くてイライラしてない!?

SDS-PAGEにおける分子量とマーカー移動度の片対数グラフでの調べ方についての質問です。

コラーゲンI型についてウエスタンブロットを行ったところ、予想以上にバンドが出てしまいました。そこで、分子量とマーカーの移動度から検量線を作ることになりました。

マーカーの移動度を定規で測り、エクセルにて縦軸を分子量(対数)、横軸を移動距離としてグラフを作りました。
その後、近似直線(曲線?、指数近似)とその数式を出してみると、
右肩下がりのy = 497.41e^(-0.0297x)という数式が出ました。

分子量が大きい物ほど移動度が小さいというのはわかるのですが、これであっているのかわかりません。

また、その数式から分子量(y)が分かっているときに移動距離(x)を求めたいのですが、
=log(497.41*2.71828,y)/(-0.0297)で計算すると移動度がマイナスになってしまいます。

どこで間違っているのかが分かりません。
どなたかご教授頂ければ幸いです。

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A 回答 (1件)

書かれている計算式がよくわからないのですが、なんかlogの展開がおかしいような・・?



よくわからないのでlogの展開の決まりを下に書いておきますのでご自分で検算してください。
Y=A*B/Cを両辺対数取ります。対数取ると、かけ算は足し算に、割り算は引き算にします。
logY=logA+logB-logCです。
それから、e^(-x)=1/e^(x)です。つまり497.41e^(-0.0297x)=497.41/e^(0.0297x)
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この回答へのお礼

丁寧な回答ありがとうございます!!
計算式を参考にさせていただき、計算し直してみました。

y = 497.41*e^(-0.0297*x)
y = 497.41*1/e^(0.0297*x)
y = 497.41/e^(0.0297*x)
log(Y) = log(497.41) - (0.0297*x)*log(e)
log(Y) = log(497.41) - 0.0297*log(e)*x
0.0297*log(e)*x = log(497.41) - (logY)
x = (log(497.41) - log(Y))/(0.0297*log(e)

これでやってみたところ納得の値が出ました。
ほんとに助かりました!ありがとうございました!!

お礼日時:2008/07/25 15:11

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QSDS-PAGEについて

大学の実験でやったSDS-PAGEのレポートを書くんですが、タンパク質の分子量と泳動度を使いグラフを作る課題があるんですが、kDというのが分子量だとは思うのですが泳動度をどのように求めたら良いのかがわかりません。参考書に比移動度というのがあり、分子量の対数に逆比例する。と書かれているものがあったのですが、これと泳動度は同じものなのでしょうか?この実験には分子量マーカーと成分のわからないタンパクを使ったのですが、マーカーを使いグラフを書くんでしょうか?生物系はまったく判らないのでよろしくお願いします。

Aベストアンサー

↓の参考URLを読んでみてください。
たぶん、お分かりになると思います。
説明の中でMrというのは分子量のことです。
分子量がわかっている数種類のタンパク質を、先行色素(ブロモフェノールブルー(BPB)など)とともに泳動させます。そして先行色素の泳動度を1としたときの、各試料の相対的な泳動度を比泳動度(Rf)といいます。
横軸にRf、縦軸にlog[分子量]をプロットすると、右下がりの直線に近いものが得られます。
この直線の式を最小二乗法によって求めます。
x = Rf, y = log[Mr]として
直線の式は y = ax + b
の形になるはずです。
(右下がりの直線なので、a<0)

これに分子量が未知の試料のRfの値を代入すれば、分子量が求められます。

参考URL:http://www.jp.amershambiosciences.com/products/kouryaku_electro/applic_guide/008-2.asp

Q電気泳動によりDNAの分子量を求める方法。

先日、実験でDNAの電気泳動を行いました。
それで、電気泳動の結果からDNAの分子量を求めなくてはならないのですが、いまいちよく分かりません。

電気泳動をしたのは標準マーカーと制限酵素処理する前のDNA、した後のDNAです。
標準マーカーはバンドが23、9.5、6.5、2.3、2.0に現れました。
制限酵素処理前のDNAはバンドが9.5に現れました。(した後については事情により省略させてください。)また、単位はKbpです。
自分でも考えてみたのですが、DNAの長さが分かっただけで分子量がどのように得られるのかさっぱり分かりません。
この結果からどのように分子量を求めていけばよいのでしょうか?
どなたかご教授願えませんでしょうか。よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

制限酵素処理する前のDNAはlinear DNAですか?plasmidだと制限酵素処理前だと環状をしていますので、正確なDNAの長さがでません。オープンサーキュラーとクローズドサーキュラーというやつです。制限処理をした後のバンドの長さの合計でDNAの全長を算出し、それに660をかければOKです。
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Qエクセルで片対数グラフを作る

エクセルで片対数グラフを作る方法を詳しく教えてください。お願いします。

Aベストアンサー

グラフの数値軸のところで右クリックして
軸の書式設定(O)→目盛(タブ名)

対数目盛を表示する(L)
にチェックを入れてください。

QSDS-PAGE 移動度について

こんにちは!!
大変初歩的な質問で申し訳ないのですが、ご回答お願いいたします。

大学でタンパク質の精製実験をし、チトクロムCの純度が上がっていくのを確認するためにSDS-PAGEをおこないました。
SDS-PAGEでは、マーカーのRf値と分子量の対数値をプロットしたグラフを作成し、そこから分子量未知の試料の分子量を求めるということは理解しています。

Rf値は、ブロモフェノールブルーの移動度を1とした各試料の相対移動度であるということですが、ブロモフェノールブルーの移動度はどこからわかるのでしょうか。
SDS-PAGEの結果のカラーコピーがあるのですが、これをものさしで測ってやればいいのでしょうか?(>_<)
ご回答お願いします。
あと、試料は、タンパク質精製のいろいろな段階からとったもので3種類あります。これらの試料から、チトクロムCの純度を求めるのですが、これはSDS-PAGEで染色されたすべての部分の総分子量(1)とチトクロムCの分子量(2)をもちいて、
(2)/(1)で求めればいいのでしょうか?

いろいろな文献を読んでもわかりませんでした。
大変初歩的で申し訳ないですが、ご返答よろしくお願いします。

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Aベストアンサー

実習みたいな中身だけど、それなら担当教官に訊けば良いと思うが・・・?

>ブロモフェノールブルーの移動度を1とした各試料の相対移動度であるということですが、ブロモフェ
ノールブルーの移動度はどこからわかるのでしょうか。
意味がよくわかりませんが、ブロモフェノールブルーがどれだか解らないのですか?

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はい、そうです。普通はゲル上端からの距離を測ります。
ところで、バンドには太さがありますね。バンドの上端、真ん中、下端間での距離のうちどこが良いと思
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ク質量をどんどん増やしてみます。するとバンドはどんどん太くなり、それにつれて、真ん中と上端の位
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ですが)、下端が一番おすすめです。

>タンパク質精製のいろいろな段階からとったもので3種類あります。これらの試料から、チトクロムCの
純度を求めるのですが、これはSDS-PAGEで染色されたすべての部分の総分子量(1)とチトクロムC
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Q片対数グラフの書き方について。

エクセルのグラフ作成ソフトを使って、正確な片対数のグラフを作ることは可能でしょうか?
現在遺伝子の研究をしているのですが、サンプルのDNAの分子量を求めるのに片対数グラフを書くことが必要なのです。手書きで書いてみたのですが、正確に書くことができません。 どうにか正確なものを書きたいと思ってるので、どなたか御存知の方の回答お願いします。

Aベストアンサー

片対数グラフを作成する方法は2つ。
1.折れ線グラフを作成し、y軸を選択後右クリックから、対数目盛りをチェックすると、y軸が対数目盛りになります。ただし、最小目盛りは10
2.散布図の線のついたものを選択し、作成。この場合はxまたはy軸を選択し、同じく対数目盛りを選択。

片対数グラフの場合は、折れ線、散布図どちらでも可能ですが、両対数の場合は散布図を選択することになります。
グラフは正確ですが、途中でデータを読む場合はメモリ間隔が荒いので、読みにくいと思います。

QSDS電気泳動について教えて下さい。

SDS電気泳動ってどういうものなのでしょうか?
検索してみるとタンパク質の変性を加えて用いるということは分かったのですが、
それ以外のことは分かりません。
どなたか詳しい方教えて下さい。 

Aベストアンサー

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲルの「網目」を通過させる(大きいサイズほど流れにくく、小さいサイズのタンパク質は流れやすい)
というものです。網目を通過しやすいかしにくいかでタンパク質の長さを測定します。結果として、ゲルの下の方には小さいタンパク質が、上の方には大きいタンパク質がきます。

SDSで変性させる理由ですが、タンパク質を直鎖状にすることです。タンパク質はその機能を発揮するために特有の立体構造(疎水結合やジスルフィド結合などを利用して)を形成します。タンパク質をそのまま泳動すると、ポリアクリルアミドゲルの「網目の通りやすさ」はタンパク質の長さだけに影響されず、タンパク質の形状(立体構造)にも影響を受けます。

SDS-PAGEを行う場合の多くは、タンパク質の長さだけを知りたいので、タンパク質の立体構造に影響される電気泳動は望ましくありません。そこで、SDSでタンパク質を直鎖状にして電気泳動します。

では、SDSをいれるとなぜ、タンパク質が直鎖状になるか、です。SDSは親水基と疎水基の両方をもつ化合物です。そして、その親水基は負(マイナス)に荷電しています。

タンパク質の立体構造はアミノ酸残基(アラニン、グリシン、リジン、トリプトファン・・・)の性質(特にアミノ酸残基がもつ電荷)の影響を大きく受けます。SDSがタンパク質に作用すると、SDSの疎水基側がタンパク質に親水基側が溶媒側に結合します。このタンパク質に結合したSDSの親水基(マイナスに荷電)がタンパク質を構成する様々なアミノ酸の特性を打ち消してしまいます。結果として、SDSが結合したタンパク質はアミノ酸残基の影響をうけられなくなり直鎖状になります。

また、このようにSDSが結合したタンパク質はマイナスに荷電しますので、電気泳動をするとタンパク質(とSDSの複合体)はマイナスからプラスの方へ泳動されていきます。

最後に、立体構造に大きな影響を与えるジスルフィド結合に関してです。このジスルフィド結合はSDSによって壊されません。そこで、多くのSDS-PAGEを行う場合は、SDSと共に2-mercaptoethanolやDTTといったジスルフィド結合を壊す還元剤で処理したタンパク質を電気泳動します。

なお、立体構造も含めて解析したい場合は、Native PAGEと呼ばれる方法で電気泳動を行います。

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲ...続きを読む

Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

Q分子量のマーカー(DNAラダー)の移動度とサイズ(bp)の関係

分子量のマーカー(DNAラダー)の移動度とサイズ(bp)の関係をグラフにプロットせよ。
また,そのグラフから各々のプラスミドに組み込まれていたインサートの長さを測定せよ!!!!
という問題で、分子量のマーカー(DNAラダー)の移動度とサイズ(bp)の関係をグラフにプロットせよ。はで来たのですが、そのグラフから各々のプラスミドに組み込まれていたインサートの長さを測定せよ、という問題が分かりません。どうやって解けばいいのか教えてください。そもそもインサートってなんですか?

Aベストアンサー

プラスミドを制限酵素で切断し、DNAを挿入する事です。または挿入されたDNA断片の事です。

グラフができたのであれば、インサート済みのプラスミドの泳動実験からプラスミドのbpが推測できますので、元のプラスミドのbpとの比較からインサートされたDNAの大きさを推定する事ができると思いますが。


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