グラム染色によってなぜ陽性菌と陰性菌に染め分けることができるのか教えて下さい

A 回答 (2件)

細胞壁の脂肪の組成の違いにより、紫色に染まった菌をグラム陽性菌、赤く染まった菌をグラム


陰性菌と呼びます。この染色法を応用すると全ての細菌は2種類に分類できます。
『なぜ陽性菌と陰性菌に染め分けることができるのか』というご質問ですが、染め分けられた
菌を、『陽性菌』『陰性菌』と呼び分けているだけです。さらに、それぞれを菌の形で
『球菌』『桿菌(かんきん)』に分けて分類しています。
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レポートでしょうか・・・・?


以下の参考URLサイトは参考になりますでしょうか?
「微生物学実験テキスト」

ネットで検索しましたか?
図書館で「微生物学」あるいは「細菌学」等の成書を見れば記載があるとおもいますが・・・・?

補足お願いします。

参考URL:http://www.busitu.numazu-ct.ac.jp/suzuki/tshp/bt …
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Qグラム陽性菌がグラム陰性菌に変化することってありますか?

馬鹿な質問かもしれませんが、ちょっとした疑問があります。
グラム陽性菌をシャーレの寒天培地で培養し続けているとグラム陰性菌に変化することってありますかね?

単なる染色方法の不備かもしれませんが、陽性菌から陰性菌に変化する菌ってあるのですかね?
知識のある方、どうぞお暇なときに教えて頂ければ幸いです。

Aベストアンサー

この問題には二つの、全く関係がない要素が混在しています。ひとつは定義というか実際の細菌の細胞壁の構造の違いです。外膜の有無と細胞壁そのものの構造の違いです。グラム染色性の違いはペプチドグリカンの構造の違いと関係があるようですが、グラム陽性菌のペプチドグリカン層が厚いことで水に不溶性の色素ヨウド複合体がより多く沈着するという説があると思います。この複合体はアルコールにはよく溶けるので、アルコールで脱色しすぎると、グラム陽性菌も陰性菌と同じように見えます。また培養が古くなって死んだ菌はペプチドグリカンも断裂していて不溶性複合体を保持できないのでグラム陰性に染まることがあると思います。いずれにしても遺伝学的な意味でグラム陽性菌が陰性菌ンに変化することはありません。しかしLフォームという細胞壁が消失して様な特殊な状態はあるようです。Lフォームはグラム陰性に染まるそうです。

Qホルマリン固定後のグラム陽性菌の染色

菌を使用した実験を始めるように言われました。染色に関して教えてください。
Vivoでの研究なので、Agarでの培養以外に組織のホルマリン固定をしています(生標本ではありません)。この組織標本を使用して、細菌が存在しているのか、あるいは白血球に貪食されているのか、を見ようと思います。それを見るのに、どのような染色が良いのでしょうか?
通常のHE染色で良いのか?ホルマリン固定後でもグラム染色で良いのか?他の染色が良いのか?
教えていただけたらと思います。よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

こんばんは.

>『ルマリン固定後のグラム陽性菌の染色』
>菌を使用した実験を始めるように言われました。染色に関して教えてください。
>Vivoでの研究なので、Agarでの培養以外に組織のホルマリン固定をしています
>(生標本ではありません)。
>この組織標本を使用して、細菌が存在しているのか、
>あるいは白血球に貪食されているのか、を見ようと思います。
>それを見るのに、どのような染色が良いのでしょうか?
>通常のHE染色で良いのか?
>ホルマリン固定後でもグラム染色で良いのか?他の染色が良いのか?


蔵書の表題『染色法のすべて』の,『VII.染色体検査』(P65)から,
ご質問に該当する下記染色法の部分を転載します.
ちなみにこの書籍の発行所は『医歯薬出版(株)』で,
多くの医師や臨床検査技師による共著です.
医学系臨床の現場で使用されているもので,改訂版も出ているようです.

29.グラム染色法(Gram stain)

【目的】
デンマークのHans Christian Joacim Gram(1853~1938)が,
1884年に発表した染色法(注1)で,この染色法により細菌などの微生物は,
グラム陽性菌Gram-positive micro-organismsと
グラム陰性菌Gram-negative micro-organismsとの染め分けをして,
細菌の種族同定の一助にしようとするものである.

組織切片についてのグラム染色法は,Brown and Brenn法(注2),
MacCallum-Good-pasture法(注2),Taylor法(注2),
Huckker-Conn法などの多くの方法が報告されている.
これらのグラム染色のWeigertの変法(注4)は脱色液としてアニリン・キシロールを使用し,繊維素fibrinの染色法として広く用いられている.

【準備】
通常の10%ホルマリンで固定した組織を型のごとくパラフィンに包理し,薄片は5~6μmくらいまでの薄い方がよい.なお,グラム染色には中性ホルマリンで固定した組織の方が染め上がりがよいとされている.
【試薬の調整】
ⅰ)グッドパスチャーのアニリン・石炭酸フクシン液
  塩基性フクシン・・・・0.59g
  アニリン・・・・・・・1.0ml
  石炭酸結晶(融解)・・ 1.0ml
  30%アルコール・・・100.0ml

ⅱ)グラムのヨード液
  ヨー素・・・・・・・・1.0g
  ヨー化カリ・・・・・・2.0g
  蒸留水・・・・・・・・300.0ml

はじめに,ヨー化カリを少量の蒸留水と溶解させ,
完全に溶かした後にヨー素を加え,蒸留水を加えて完全に溶解させる.

ⅲ)スターリング(Stirling)の液
  クリスタル紫(またはゲンチアナ紫)・・0.5g
  純アルコール・・・・・・・・・・・・10.0ml
  アニリン・・・・・・・・・・・・・・ 2.0ml
  蒸留水・・・・・・・・・・・・・・・88.0ml

ⅳ)飽和ピクリン酸溶液
  ピクリン酸・・・2.0g
  蒸留水・・・・100.0ml
スターリングの液はゲンチアナ紫が原法であるが,
クリスタル紫の方がよい.
『化学構造(添付画像に掲載しています)』
クリスタル紫の溶解性は20℃の水には1.43%,
アルコールには5%である(注1)

【手技】
(1)組織切片を型のごとく脱パラフィンして蒸留水に入れる.
(2)グッドパスチャーのアニリン・石炭酸フクシン液で
10分間染色(室温)
(3)蒸留水に浸漬,水洗.
(4)40%ホルマリン
(市販のホルマリン原液をそのまま使用する)で,
切片が鮮紅色になるまで1~2分間分別する.
(5)流水中で3分間水洗.
(6)飽和ピクリン酸溶液に3~5分間浸漬する.
切片は紫黄色となる.
(7)蒸留水で水洗.
(8)95%アルコール中で約30秒間分別.
(9)蒸留水で水洗.
(10)スターリングの液で3分間染色.
(11)蒸留水で十分に水洗.
(12)グラムのヨード液に1分間浸漬.
(13)蒸留水で簡単に水洗し,濾紙で切片面の水分を吸い取り
半乾きとする.
(14)アニリン・キシロール等量液中で十分に分別する.
切片が明るい淡紫赤色となり,
紫色の脱色がなくなるまでを目安とする.
(15)キシロールで透徹,2回.
(16)封入.

【コツ・注意点】
 (8)のステップは30~60秒とやや長めに行う.
 (10)のステップでは,一枚ずつ染めて次のステップにうつす.
 一度に多数の切片を染める場合には,一回に5枚以内にした方がよい.
 過染すると(14)のステップでの分別が上手くゆかない.
 (12)のステップは長すぎないようにする.
 (13)のステップでは,濾紙で切片上の水分を軽く吸い取り,そのまま数分間放置して半乾きとする.観想させてしまってはいけない.
 (14)のステップでは,最初にアニリンのみによって分別すると分別が早く行われる.アニリンは新鮮なものを用いることがコツの1つである.なお,(4)のステップはホルマリンを染色バットに十分に入れて,その中を切片を往復させる方法によって分別する.時間は短めの方がよい.

【染色態度】
グラム陽性菌:濃青色
グラム陰性菌:赤色
その他の成分:淡赤~紫色まで種々の色調を示す.

【参考文献】
1)Law,J.W. & Oliver,Hj.:Glossary of histo-pathological terms. Butterworths,London,1973.
2)Luna,L.G.(Ed):Manual of histologic staining methods of the AFIP(3rd Ed.)Mcgraw-Hill,NY.,1968.
3)小林忠義,影山圭三(編):病理組織標本の作り方(第3版).医学書院,1971.


24年もさかのぼる昔に学んだ関係書物からの内容でした.
今の私にとってはこの知識も現在の古生物の研究には,
薄片試料を染色する必要が無いため直接役に立っていません.
つまり知識の更新が行われていませんのでご了解ください.

なお図書館で『染色法のすべて』を読まれることも考慮してください.

お役に立てばと,
今夜の仕事を終わって急いでキーボードを叩き,一気に作成しました.
それでも現在時刻は午前1時を過ぎています.
明日のこともあり読み直す暇がありません.
脱字や誤字があることも考えられますが,
その際は機知にてご判断されご笑納ください.

この回答が,
ご質問者さまの疑問解消の一助になれば幸いです.

こんばんは.

>『ルマリン固定後のグラム陽性菌の染色』
>菌を使用した実験を始めるように言われました。染色に関して教えてください。
>Vivoでの研究なので、Agarでの培養以外に組織のホルマリン固定をしています
>(生標本ではありません)。
>この組織標本を使用して、細菌が存在しているのか、
>あるいは白血球に貪食されているのか、を見ようと思います。
>それを見るのに、どのような染色が良いのでしょうか?
>通常のHE染色で良いのか?
>ホルマリン固定後でもグラム染色で良いのか?...続きを読む

Qグラム陽性菌からのプラスミド抽出について

私は大学院生をしており,微生物の遺伝子について研究を行っています.
しかし,最近は実験をしても,期待するような成果が得られず実験が滞っています.
その実験というのは「グラム陽性菌からのプラスミド抽出」です.
院生でありながらこのような質問をするのは非常に恥ずかしい事だとは分かっているのですが,最近は全然うまくいかず,非常に困っています.
このグラム陽性菌が有する約120 kbのプラスミドを抽出したいのですが,アルカリ法で抽出した後にアガロースゲル電気泳動を行ってもバンドを確認することができません.
また,この菌は複数のプラスミドを有しており,比較的サイズの小さなプラスミド(約20 kb以下)までは頻繁に確認することができます.

以下に実験手順を記入しますので,このような大きなプラスミドでも抽出できるようにするためのアドバイスをしていただきたいです.

1.前培養:植菌して12~20時間振とう培養 30℃ LB液体培地 
2.本培養:前培養液から50 μLを5 mLのLB液体培地が入った試験管に添加,6~8時間30℃で培養
3.本培養液全量を15 mL容チューブに移し,遠心分離.
4.培養液を捨て,沈殿にSolI 9mLを加えて激しく撹拌
5.この溶液を遠心分離し,溶液を捨てる
6.沈殿に1 mLのSolIを加え,激しく撹拌
7.16 mg/mLの濃度でリゾチームを溶かしたSolIを1 mL加えて穏やかに混合
8.37℃で2時間30分~4時間反応させる.(30分を目安に穏やかに混合)
9.SolII 4 mLを加え,穏やかに混合,5分間室温で放置
10.SolIII 3mLを加え,穏やかに混合,20~30分間氷上で放置
11.この溶液を冷却遠心分離,沈殿は廃棄し,溶液のみを新たな15 mL容チューブに回収
12.イソプロ 7 mLを加え,混合.室温で1時間放置
13.冷却遠心分離を行い,沈殿を800 μLのTE溶液に溶かす
14.この溶液を1.5 mL容チューブに移し,フェノールクロロホルム溶液600 μLを加えて5分間混合
15.遠心分離を行い,上層の溶液を新たなチューブに回収(タンパク質の層を回収しないように注意)
16.14~15の操作をもう一度行う.
17.回収した溶液にイソアミルアルコール/クロロホルム溶液600 μLを加え混合
18.遠心分離をおこない,上層の溶液を新たな1.5 mLチューブに回収
19.この溶液に3M 酢酸ナトリウム溶液を添加(回収した溶液の1/10量の酢酸ナトリウム溶液)
20.この溶液と等量のイソプロを加え,室温で2時間放置
21.遠心分離を行い,溶液を捨て,沈殿に70%エタノールを加え遠心分離
22.溶液を捨て,5分程この沈殿物を乾燥させる
23.沈殿をTEに溶解させ,サンプル完成 (この時RNAも除去しています)

このような実験手順なのですが,何かアドバイス,不備な点などがあったら教えてください.宜しくお願いします(キットを使うというのは無しで・・・).

PS.この大きなプラスミドは今まで抽出できたことがないわけではなく,この一年ほどで回収できる頻度が著しく低下しているという状況です.作り置きしておいた試薬を作りなおしているのですが,なかなかうまくいきません.失敗したときのアガロース電気泳動写真も添付しておきます.

私は大学院生をしており,微生物の遺伝子について研究を行っています.
しかし,最近は実験をしても,期待するような成果が得られず実験が滞っています.
その実験というのは「グラム陽性菌からのプラスミド抽出」です.
院生でありながらこのような質問をするのは非常に恥ずかしい事だとは分かっているのですが,最近は全然うまくいかず,非常に困っています.
このグラム陽性菌が有する約120 kbのプラスミドを抽出したいのですが,アルカリ法で抽出した後にアガロースゲル電気泳動を行ってもバンドを確認するこ...続きを読む

Aベストアンサー

昔ながらの手法で、キットは使わずに精製されているのですね。昔はできていたのに、最近とれなくなったということから、いくつかの可能性が考えられます。

1)培地の抗生物質
抗生物質の活性は落ちていませんか?活性が落ちていると,培養中にプラスミドが抜け落ちてしまいます。本培養を止める1~2時間前に、抗生物質を培地に追加し、培養を続けることで、プラスミドが落ちるのを避けることができます。

2)SolIの温度
SolIは常時4度保存、使用時に氷冷していますか?中に酵素(RNase)が入っています。酵素が弱っている可能性はないですか?撹拌も、培養液の4度を保ったまま行ってください。

3)SolIでの撹拌
debrisは残っていませんか? cell debris が完全になくなるまでボルテックスで、もしくはピペッティングでよく撹拌してください。ここが一番収量にきいてきます。

4)イソプロ処理
イソプロ処理で、DNAを失っていませんか?
DNAをロスしそうなイソプロ処理(12のステップ)を省略し、容量の大きいまま、フェノクロ処理、イソアミルアルコール/クロロ処理をします。もしどうしても、体積を減らす必要があるなら、イソプロ処理をします。

5)エタノール沈殿
エタノールの濃度が70%より低くなっていませんか?
容量が大きいままでも良いなら、イソアミルアルコール/クロロ処理の後は、塩(3M NaoAc)を入れて、そのままエタ沈の操作にうつりましょう。リンス用の70%エタノールは毎回、要時調整し、作り置きしないこと。

6)DNAの溶解
完全にDNAは溶液に溶けていますか?
得られたDNAのペレットは完全に乾かしてしまうと、溶かすのに大変苦労します。
乾いたか乾いていないかのぎりぎりの状態まで乾かし,TEもしくは蒸留水で溶かすと、くるくるとペレットが回るように溶けます。

思いつくのは以上です。たっぷりととれるといいですね。
がんばってくださいね。

昔ながらの手法で、キットは使わずに精製されているのですね。昔はできていたのに、最近とれなくなったということから、いくつかの可能性が考えられます。

1)培地の抗生物質
抗生物質の活性は落ちていませんか?活性が落ちていると,培養中にプラスミドが抜け落ちてしまいます。本培養を止める1~2時間前に、抗生物質を培地に追加し、培養を続けることで、プラスミドが落ちるのを避けることができます。

2)SolIの温度
SolIは常時4度保存、使用時に氷冷していますか?中に酵素(RNase)が入っています。酵...続きを読む

Qグラム染色法で古い細菌が陰性になるわけ?

グラム染色法で若いときは陽性だった細菌が陰性になるわけを教えて頂けないでしょうか?

Aベストアンサー

図書館で調べた限りでは、グラム陽性に染まる細菌の細胞壁を構成しているペプチドグリカンが立体的になっていてルゴールと反応して水に溶けにくくったゲチアナヴァイオレットが、グラム陰性菌に比べて大量にペプチドグリカンの網目に保持されているので、アルコールによって全部が溶出されるには長時間を要すると書いてありました。グラム陽性菌でもアルコールで脱色しすぎるとグラム陰性のようになってしまいますが、古い菌ではペプチドグリカンが部分的に分解しているので色素の保持量も減り、又アルコールが浸透しやすくなるので、色素が抜けてグラム陰性に染まってしまうそうです。

Qグラム陰性、陽性について教えて下さい。

グラム陰性菌、陽性菌というものがあり、wikipediaにある通り
染色によって紫色に染まるものをグラム陽性、紫色に染まらず赤く見えるものをグラム陰性という。この染色性の違いは細胞壁の構造の違いによる。グラム陽性はペプチドグリカン層が厚く脂質が少ない細胞壁を持ち、グラム陰性はペプチドグリカン層が薄く脂質が多い細胞壁を持つ。そしてこの細胞壁の構造の違いは、この両者が生物学的に大きく違うことを反映しており、グラム染色は細菌を分類する上で重要な手法になっている。
といったことは分かっているのですが、この違いは染色されるかされないかという違い以外にどういう違いがあるのでしょうか?
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

殺菌剤や抗生物質の耐性に違いが出ます。
その物質の作用機序にもよりますが。


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