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グルタチオンによってGSTをもつたんぱく質を精製するというのを学んだのですが、よくわからないことがあります。詳しい方がいましたらお教えください。
1)まずGSTをグルタチオンをもつビーズと結合させ、その後で還元型のグルタチオンで遊離させるということなのですが、なぜ還元型なのでしょうか。拮抗させるためなら還元型でなくてもいいような気がします。還元型のほうが結合しやすいなどの理由があるのでしょうか。
2)回収時に、どのようにして一度ビーズのグルタチオンに結合していたGSTが液中のグルタチオンと結合するのですか?結合が解除されるメカニズムを教えてください。

A 回答 (1件)

詳しく知らないので自信がないのですが、酸化型グルタチオンはSS結合で二量体となると思います。

つまり、酸化型グルタチオンはフリーなSH基がないので、GSTと結合できないのではないでしょうか?
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QGST融合タンパク

現在、目的のたんぱく質をGST融合タンパクとして大腸菌内で発現させ、アフィニティーカラムを用いて精製を行っています。上清には十分量でてきているのですがカラムを通してもほとんど吸着しません。しかも少ないながらも吸着したものを溶出してもでてきません。グルタチオン濃度を上げてみましたが変わりませんでした。トラブルシューティングを参考にしながら考えられるところを変えてみましたが改善されませんでした。周囲の人に聞いても良い回答は得られませんでした。現在のところ目的のタンパク質の構造による影響と考えていますが、このままではいつまでたっても十分量精製できないので非常に困っています。同じ様な経験がある方、こんなふうにしたら解決したなどありましたらおねがいしますm(_ _)m ちなみに目的としているタンパク質は20kDaです。

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破壊するときのバッファーの組成は?PBS使用ですか?
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Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
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Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

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2.DTT入りのbufferを2週間ほど冷蔵保存して使用したところ思うような酵素活性が得られませんでした。DTTは一般に用時調製するものなのでしょうか?

3.仮に用時調製するにしても毎回微量を秤量するのは効率的ではありません。DTTの濃いstock溶液をつくり一定期間使用することは可能でしょうか?その場合、溶媒、保存方法はどうすればよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

1.酸化防止です。基本的なことですからタンパク精製の本にあると思います。ベータメルカプトエタノールも同様な働きです。

2.用事添加が基本です。察するに酸化に弱い酵素なのでしょうね。

3.1Mのストックで私は使用してます。比較的に安定です。ファイナルで1mMほどで使うことが多いので千分の一加えることになります。この場合は水で溶かせば問題ないです。別にバッファーでも問題はないと思いますけど。
使用期間ですが、実験の精度や酵素の性質によるので何ともいえません。10mlも作って分注して試されたらよろしいかと思います。

Q2つのシークエンスによる結果の違い

PCR後の精製産物をシークエンスするダイレクトシークエンスとクローニングしてプラスミド回収してからのシークエンスの2パターンで配列解析をしました。

するとダイレクトシークエンスはうまく読めたのですが、もう一方のシークエンスのほうは、配列を読めずNと表示されました。

一般的にダイレクトシークエンスは、うまく配列を読むことが困難だということを聞いたことがあります。

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またダイレクトシークエンスの長所は、クローニングをしないので短期間でシークエンスが可能。短所は読めない配列が多いと聞いたことがあります。
そこでクローニング済みのシークエンスのほうの長短所って何なのでしょうか?

回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

こんにちは。

実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa(配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね)が5個なので、鋳型はA型が3に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、1:1ではなく、2:1とか4:1の定量性を見るのは難しいかと思います。

ダイレクトシーケンスは、増えたPCR産物をそのまま読むために、鋳型のある塩基が----taatGc----と----taatCc----が1:1で含まれているとき(ヒトゲノムでは父方と母方の塩基が違うことがよくあります)、次のようなメリットが考えられます。
・(メリット)そのシーケンスの波形はGとCが一対一で出てくるように定量性がややあること
・(メリット)シーケンシング反応はたまにエラーを起こしますが、それはマイノリティになります。正しい配列の波形の方が大きく出るので、鋳型の配列にほぼ一致した配列が読めます。

クローニング済みのシーケンスは、1クローンだけ読むと、その配列がシーケンシング反応によるエラーの塩基置換を含む危険性が高い一方で、
・一見、単一の産物に見えても1塩基レベル、あるいは全体にわたって複数の産物がPCRで増幅されたときに、複数のクローンをシーケンスすることでなにが増えたか調べられます。ダイレクトシーケンスではこれは難しいです。
・(先の方も書かれていますが)基本的には単一のプラスミドの配列を読むため、シーケンスがきれいに読めるはずですし、その後の応用(発現用のベクターに入れる)にはプラスミドでの塩基配列の正しさの確認が必要です。

クローニングしたプラスミドを読む場合はインサートの長さにもよりますが、最低3個くらい読んだ方が良いと思います。

プラスミドのシーケンスがうまくいかなかったとのことですが、制限酵素で確認されたのことでものは入っているのだと思います。シーケンシング反応はエタ沈がちょっとマズイだけでシーケンスが読めなくなったりするので、もう一回同じ事をやると読めるようになるかもしれません。
シーケンシングプライマーですが、プラスミドにあるシーケンシングプライマーの配列(T7, SP6, M13など)が実は、シーケンシング反応に有利な配列でないことがあります。最近は合成オリゴの値段も安いので、「同じ配列を複数読む」ようなことであれば、自分の入れたインサートにある配列でシーケンスされるのがよいと思います。「中から外に読む」感じです。もし、サイズが500bpとか小さいようならPCRで増やしたときに使ったfowardとreverseプライマーで網羅できるでしょう。
あと、ご存じと思いますが、シーケンス反応に持ち込むプラスミドとPCR産物の至適な量が違うので、そこの確認をされても良いかと。

また、制限酵素処理の代わりに、拾われたプラスミドを一度50uLのLBに移して、そのうちの1uLを鋳型にコロニーPCRなどでインサートの有無を確認して、インサートの入ったものだけを増やすとたくさんのコロニーをカルチャーしなくて済みます。

がんばってくださいね!

こんにちは。

実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa(配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね)が5個なので、鋳型はA型が3に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、1:1ではなく、2:1とか4:1の定量性を見...続きを読む

QW/V%とは?

オキシドールの成分に 過酸化水素(H2O2)2.5~3.5W/V%含有と記載されています。W/V%の意味が分かりません。W%なら重量パーセント、V%なら体積パーセントだと思いますがW/V%はどのような割合を示すのでしょうか。どなたか教えていただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

w/v%とは、weight/volume%のことで、2.5~3.5w/v%とは、100ml中に2.5~3.5gの過酸化水素が含有されているということです。
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Qヒートショックをするのには何か意味があるのでしょうか??

コンピテントセルにプラスミドDNAを取り込む実験をしていますが、極端に冷却した後、ヒートショックという過程があることをしりました。
ヒートショックをすることには、何か意味があるのでしょうか??
コンピテントセルが脆くなってDNAがさらに取り込まれやすくなったりとかするのでしょうか??

Aベストアンサー

基本的な思い違いをなされていると思います。ヒートショックによりプラスミドがコンピテントセル内に取り込まれるんです。そのため、その前段階のメルカプト添加や冷却などはコンピテントセル表面にプラスミドをくっつけヒートショックにより取り込ませやすくするための前準備という考え方が正しいです。
詳しい原理は微生物の知見がないと難しいので、脊椎動物などの遺伝研究を行っている方は意外と原理を知らなかったりします。興味があれば調べてみるといいですよ。

Qサテライトコロニー?について

こんばんは。
初めて質問します。よろしくお願いします。

大腸菌のトランスフォーメーション実験を行い、アンピシリンとX-gal染色によりセレクションしました。
白色コロニーをコロニーPCRにかけるために選ぶ際、指導者に、サテライトコロニー(?)は白色でも正しくトランスフォーメーションされていないことが多い、と言われました。
サテライトコロニーとは、1つの大きなコロニーのまわりに小さな飛び散ったようなコロニーが見えるもののことを指すらしいのですが。
なぜ、正しくトランスフォーメーションされていないのでしょうか?確かにコロニーPCRでは増幅されませんでした。
指導者はその理由は忘れてしまったそうです(-_-メ)
調べても中々わかりません。
どなたかご存知でしたら教えてください。
参考URLでもかまいません。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

サテライトコロニーは、形質転換体のコロニーによって、培地中の薬剤が分解されたために、形質転換されていない(つまり、プラスミドを持っていない)ものがコロニーを形成してしまう現象です。

プラスミド自体を持っていないので、β-ガラクトシダーゼ活性も持ちませんから、コロニーの色は白色となります。

ちなみに、サテライトコロニーは、アンピシリン耐性で選抜するときによく見られますが、アンピシリンの代わりにカルベニシリンという薬剤を使うと、サテライトコロニーの発生をかなり抑えられます。(カルベニシリンは、アンピシリンと比べるとかなり高価ですが。)

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

QアルカリSDS法におけるDNAとプラスミドの分離について

大学生になり、生物実験でアルカリSDSを行っている者です。
アルカリSDSによるゲノムDNAとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは1本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、とありました。そしてボルテックスはsolutionIIを加えた以降は禁止で転倒混和ですが、これは激しいボルテックスによりゲノムDNAも粉々になって上清画分に出てきてしまうため、また、膜にゲノムDNAは結合していて膜とともに沈殿させることができるが、DNAが細かく切れると膜とともに沈殿させることができないため、という文もありました。疑問に思うことは以下の6つです。

(1)一本鎖になるとニックが入りやすくなるのに、プラスミドは二本鎖に戻し、ゲノムDNAを一本鎖のままにすることが、ボルテックスなどでゲノムDNAが細かくなるのを防ぎたいということと矛盾している気がします。細かくなると不都合になるのになぜわざわざ一本鎖にするのでしょうか?
(2)その後のエタ沈でDNAを沈殿させますが、一本鎖のほうが二本鎖より沈殿させやすいのしょうか?原理的にはDNAはエタノールに不溶性なため沈殿することを考えると、一本鎖でも二本鎖でも不溶性なことには違いがありませんよね?一本鎖の方がもつれて絡まりやすいから凝集するのでしょうか?
(3)ゲノムDNAは菌体の膜に結合していて一緒に沈殿しやすいというイメージがよく分からないのですが、膜に所々DNAが細胞骨格などとともに結合しているのでしょうか?何かのタンパクを介しているのでしょうか?
(4)solitionIでTris-HCl(pH.8.0)などの緩衝液を加え、菌体をボルテックスして懸濁する必要があるのは後のsolutionII以降の操作のためにどのような目的がありのでしょうか?EDTAでDNaseなどを不活性化するのは分かるのですが…。またグルコースも加えるのは何のためなのでしょう。Tris-HClで十分緩衝液になっている気がします。
(5)エタ沈の前に、フェノールクロロホルム抽出をはさむプロトコールがありました。フェノールクロロホルム抽出をはさまなくても、solutionIIのアルカリ性でタンパクは変性し、不溶性となるので、核酸と分離できるはずですが、はさむ方法もあるのは、よりタンパクを取り除くためでしょうか?
(6)こちらは、確認質問なのですが、エタ沈の目的は核酸の沈殿であって、タンパクとの分離はできませんよね?

ちまちまとすみませんが、どなたかよろしくお願いします。

大学生になり、生物実験でアルカリSDSを行っている者です。
アルカリSDSによるゲノムDNAとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは1本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、...続きを読む

Aベストアンサー

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、それを防ぐ為に穏やかな条件で回収しているのではないでしょうか。

(2)これはエタノール沈殿の条件では、一本鎖、二本鎖に違いはあまりないと思います。

(3)細胞質中で膜結合性タンパク質との巨大複合体として存在していると言われています。sol3の後の遠心で一緒に巻き込まれて沈殿する、というようなイメージではないでしょうか。

(4)EDTA等は、仰るようにDNAの安定化の為だと思います。
グルコースは浸透圧のコントロールとして、また後のエタノール沈殿のときにはDNAの共沈剤の効果があると言われています。浸透圧のコントロールとして塩を加えてもよいのですが、塩はDNAと不溶性複合体をつくりますので、最近のプロトコルはglucoseみたいですね(私が学生の頃はEDTA以外特になにも入っていませんでした)。後者はエタ沈の時にグリコーゲンを加える事があるのと一緒ではないでしょうか。

(5)仰るようにタンパク質を完全に除去する為です。目的によっては省略してもよいでしょう。また、フェノクロの後はフェノールを完全に除去するためにクロイソ処理が必須です。

(6)この場合のエタ沈はプラスミドDNAを単離することです。が、sol.3を回収すればタンパク質の分析も・・・できるかも。実際にQIAGENなどからは1本の培養系からDNA、RNA、タンパク質を同時に精製するkitがあります(ありました。今はちょっとわかりません)

(2)と(3)はゲノムDNAのtopologyの問題ですかね。
僕は専門ではありませんので、曖昧です。すみません。

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、そ...続きを読む


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