最適な遺伝子導入試薬が見つからず、困っています。。。

現在、私は培養細胞に遺伝子導入するため、遺伝子導入試薬の選択を行っています。
今までは論文や書籍(羊土社)を参考に、扱っている細胞への導入実績がある試薬について導入を試してきました。
実験上細胞核内まで遺伝を送達させたいのですが、どの導入試薬も細胞質でとどまってしまっている印象を受けています。
勉強不足とは承知の上で質問させて頂きますが、有効と思われるような遺伝子導入試薬をご存じの方はいらっしゃいませんか？
ちなみに今まで試した試薬はLipofectamine系, Oligofectamine, FuGGENE 6, HDなどなどです。

No.1 ベストアンサー 回答者： otx 回答日時： 2009/03/26 08:13

細胞とその状態、導入するDNAの種類とその精製度合い、

などによるのでその情報がないために、何とも言えません。

あと、遺伝子導入後、どのくらいの時間で、どのようなチェックの仕方で発現していないとおっしゃっているのかもわからないので、何とも言えません。

＞細胞質でとどまってしまっている印象を受けています。
こう思う理由も私にはわかりません。

なので一般論として、

細胞についてですが、もともと浮遊細胞は付着細胞に比べて導入しづらいです。また、同じ細胞でも、実験者の飼い方によって結果が大きく異なります。細胞の状態が悪いと、遺伝子導入時に死んでしまいます（うまく導入された細胞ほど）。

次に、導入する遺伝子ですが、大腸菌から精製した発現ベクターを使っている場合、大腸菌からのLPS等のコンタミは細胞にかなり悪影響を及ぼします。経験上、ミニプレップで精製したDNAはよくない気がします。

ベクターは何であれ、遺伝子によってその産物が細胞に悪影響があれば結果として発現している細胞が見かけ上いなくなります。積極的にアポトーシスを誘導しなくてもです。（まぁGFP単体を発現するような系でもチェックされていると思いますが）

発現のチェック方法ですが、付着細胞の場合はウエスタンでもFACSでもかなり効率よく発現が確認されることも多いと思います。
しかし、初心に返って使っている抗体がちゃんとワークしているか確認は必要なときもあります。

浮遊細胞の場合は、ウエスタンで発現がチェックできるほど発現が高くないかもしれません。FACSにおいて、発現していない細胞に比べて10～100倍くらい明るい細胞が10％としかいないこともザラにあります。

以上が思いつく一般論です。あまり細かいことは言えないと思いますが、
ある程度情報がないとコメントしづらいと思います。

この回答への補足

ご回答ありがとうございました。
実験の内容をどこまで明らかにしても大丈夫かわからなかったので、情報不足になりました。失礼いたしました。
細胞は接着細胞で、導入している遺伝子はオリゴヌクレオチド約40merです。
オリゴに蛍光物質をつけていますので、導入後経時的に蛍光顕微鏡で発光位置を観察し、核には導入できていないと判断いたしました。
再度検討を重ねたいと思います。
貴重なご意見ありがとうございました。

補足日時：2009/03/26 13:27

No.2 回答者： ga111 回答日時： 2009/03/26 09:18

>Lipofectamine系, FuGENE 6

これらで、普通は行くはずです。なぜなら、安定発現株をNeo抵抗性などで取得すると、一般には核内DNAにプラスミドが組み込まれたかたちになるからです。

また、GFPの発現で見た場合、普通は、プラスミドが核内に移行して、転写され、その後、転写産物が細胞質に移行し翻訳されたと考えます。よって、GFPの発現が十分にあるのなら、ふつうはどれくらい細胞質でとどまってしまっていても十分と考えます。

＞細胞質でとどまってしまっている印象を受けています。

よってこれがどうして問題になるのか？どのようにしてそういう印象があるのかを明らかにすると解決が得られるかもしれません。

この回答へのお礼

ご回答ありがとうございました。
実験について詳細を記述できず、失礼いたしました。
もう一度条件検討から行いたいと思います。
貴重なご意見、どうもありがとうございました。

お礼日時：2009/03/26 13:42