DH5αにPSTV29をエレクトロポレーションし、X-galをまいたCP添加LB寒天培地に10μl、50μlそれぞれまきました。生えたのは、コロニー数が少なかったですが、青色コロニーと水色コロニーでした。
3度ほど試しましたが、目的の白色コロニーが出ないので、今の所原因は、エレクトロポレーターの故障か、培地に問題があるのか分かりません。
分かる方よろしくお願いします。 

それとDH5αってCP耐性を持っているんですか?
お願いします。

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A 回答 (3件)

DH5aは抗生物質耐性をもちません。


クロラムフェニコールをどの程度の濃度で使用しているのか
わかりませんがコロニーが出ているのならばおそらく問題ないでしょう。

きちんとインサートが入ったplasmidでも読み枠があってしまったり
インサートの中から翻訳が開始されたりする可能性があるため
100%白くなるわけではありません。
水色のコロニーに対してインサートチェックをしてみることをお勧めします。

機械や手順を含めエレクトロポレーション自体はうまくいってると思います。
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こんにちは。


一応確認しますが、pSTV29をそのまま入れてないですよね?
lacZを潰さないと青くなるのは当然なので。

そうでないなら、コロニーは生えているようなので、エレクトロポレーターより制限酵素やライゲーションを疑ったほうが良いと思います。

ちなみにDH5alphaは当然CP耐性を持っていません。
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カラーセレクションだけを信用して実験するのは、簡単に言うとダメだと思います。



青色になる細かい原理はご存知だと思いますが
挿入された遺伝子によって分断されたとしてしても、読み枠があっていたりして青色になることもあるかもしれませんし、

理想的にインサートが存在していても、100%白色でないときもあります。
インキュベーション時間が長すぎると水色になってみたりとかなどなどなど。

2、3個コロニーを取ってみて確認することはよくやることです。
カラーセレクションを信用しまくるということはあまりしないと思いますが・・・。
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