マウスの副腎の免疫蛍光染色をしようと思っています。
自分なりに考えた染色の方法を書くのでおかしいところや改善したほうが良いところを指摘していただけるとありがたいです。

副腎凍結切片(パラホルムアルデヒド固定)

PBS洗浄 ×3 
10mM glycine-PBS(5min×3)
PBS洗浄
0.1%TritonX-100/PBS (RT,15min)
PBS洗浄 ×3
3%BSA-PBS (RT、30min)
10mM glycine-PBS(5min)
0.1%BSA-PBS(5min×3)
mouse-anti Ki67(1:50/1%BSA-PBS) (4℃、over night)
0.1%BSA-PBS(5min×3)
donkey-anti mouse Cy3(RT,60min)
0.1%BSA-PBS(5min×3)
F(ab')2 donkey-anti mouse(RT,60min)
0.1%BSA-PBS(5min×3)
rabbit-anti P450aldo(1;100/1%BSA-PBS)
mouse-anti P45011β(1;125/1%BSA-PBS)(4℃、over night)
0.1%BSA-PBS(5min×3)
goat-anti mouse Alexa488(1;100/1%BSA-PBS)
donkey-anti rabbit Cy5 (1;200/1%BSA-PBS)(RT,1hr)
0.1%BSA-PBS(5min×3)
封入

以上です。長い文章ですがお願いします。


   

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A 回答 (3件)

あと、マウスの組織をマウスの抗体で染めるというのは危険名のことなので、ニチレイのを参考にされてください。



http://www.nichirei.co.jp/bio/technical/protocol …
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抗体を作用させるところ以外は特殊な方法でもなく、


一般的な方法でそう悪くはないと思います。

で抗体を作用させるところですが、
3重染色を行うところは、F(ab')2 donkey-anti mouseでブロッキングするということを私はしたことがありませんので、うまくいくかどうかわかりません。

色のかぶりと、抗体のかぶりにご注意を
まずは1つずつ染色した像を確認されることをお勧めします。
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この回答へのお礼

ありがとうございます。大変参考になりました。
とりあえず、1つずつ染色して像を確認していくところから始めていきたいと思います。

お礼日時:2009/05/14 18:42

抗体が沢山出てきてよくわかりません。



何をどの抗体でどう染めようというのでしょうか?

この回答への補足

mouse-anti Ki67(1次抗体) 
donkey-anti mouse Cy3(2次抗体)
F(ab')2 donkey-anti mouse(ブロッキング)
で増殖細胞を発色し、
rabbit-anti P450aldo(1次抗体)(P450aldo;副腎球状層に発現)
donkey-anti rabbit Cy5 (2次抗体)
で副腎の球状層を発色、
mouse-anti P45011β(1次抗体)(P45011β;副腎束状層に発現)
goat-anti mouse Alexa488(2次抗体)
で副腎の束状層を発色します。
この染色で副腎の球状層、束状層それぞれでの細胞増殖を観察したいと思っています。

補足日時:2009/05/14 11:08
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