現在リアルタイムPCRのスタンダードを作るためにPCR産物に含まれるプライマーを除去しようとしているのですが、どうもうまくいきません。

手法としてマイクロスピンカラムS-400HR(GEヘルスケア)とPEG沈を試してみましたが、どうしても500ng/ul近くあったDNA濃度が10ng/ulあたりにまで落ちてしまいます。

スピンカラムでは回転数を800~3000×g、遠心時間を1~4分など条件をいろいろ変えて試してみました。

PEG沈では上清を捨てる際沈澱も流してしまったのではないかと思い(沈澱は見えていませんでした)、エタ沈メイトで沈殿の位置を可視化して注意深く操作してみましたが結果は同じでした。

ちなみに扱っているDNAはβ-actinの部分的配列など、どれも150~200bp程度です。
DNAの長さに問題があるのかとも考え、500bpぐらいのを使ってスピンカラムとPEG沈をやってみましたがだめでした。



やはり自分に技術的な問題があるのでしょうか・・・。
どなたかご教授お願いします。

A 回答 (3件)

補足ありがとうございました。



一点気になったのですがPCR後の産物を,そのまま吸光測定したものと
精製後に吸光測定したものを比較していないでしょうか?

PCR後の産物はprimerや反応しなかったdNTPs由来の吸光もありますので
産物だけを精製したものは見かけ上吸光度が大きく落ちます。

他の回答者様も仰るとおり
アガロースでもPAGEでも構わないので一度泳動して
濃度の見積もりと精製をすることをお勧めします。
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この回答へのお礼

RNase_Pさんが仰る比較をまさにしていました!
たしかにプライマーやdNTPは過剰に入っていますし、正確な測定はできないのですね・・・。
やはりカラムとPEG沈はうまくいかないので、ゲルの切り出しをやってみたいと思います!
どうもありがとうございました!

お礼日時:2009/05/14 23:46

PEG沈等のプロトコルについては詳細もきかずに無責任なことをいうのは何なので、なんとなくアドバイス的なものを。



わたしの場合、リアルタイムのスタンダードはサブマリン電気泳動と切り出しで作っていました。目的断片のみなら一番確実かと。PEG沈やカラムだと鋳型が残りますしね。

あと、カラムも使ったことありますが、回収10%以下は方法の問題ではないと思います。取り説どおりやれば、ほぼ全て回収できるはずですよね。PEG沈はプロトコルが問題かもしれませんがカラムも総量が減るというのは実験の方法以外に問題がある気がします。

NanoDropは使った事ないのですが、スペクトルではなく電気泳動の光量で調べて見るのもいいも知れません。機械の問題とか試薬の阻害により、正確に測れていない可能性もありますから。

というわけで、切り出しによる精製と、PEGやカラムの精製後に電気泳動を行ってみるのがいいかと思います。
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この回答へのお礼

カラムは何人か周りの人がやっても駄目だったのでカラム自体に問題があるのかもしれません・・・。
またPEGで捨てた上清を電気泳動にかけてみたところバンドが検出され沈殿していないことがわかりました。(誤って流してしまった可能性もありますが、理由についてはまだよく分かっていません・・・)
総合して考えるとゲルの切り出しが一番良い方法に思えました。
どうもありがとうございました!

お礼日時:2009/05/14 23:33

後は限外濾過などの方法もあります。


どの手法をとるにしろ
総量の減少は避けられません。
質問には濃度しか書いてありませんが
総量はどのくらい減少しているのでしょうか?
また濃度測定はどのように行っていますか?

この回答への補足

失礼しました。
濃度測定はNanoDropを使って測定しています。
溶液が25ulあったので総量は10ugぐらい減っていると思います。

補足日時:2009/05/14 13:23
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Aベストアンサー

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 塩(3M酢酸ナトリウムをDNA溶液の1/10量)、共沈剤(ブルーデキストラン)、イソプロまたはエタノールを加えて冷凍庫にいれるとチューブの底にドロンとした粘性の高い塊ができます。この塊はこれまでに凍結サンプルを使った場合も時々できることがありましたが、今回はすべてのサンプルで発生してしまったので非常に参っています。

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ご回答をお待ちしております。
 

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Aベストアンサー

#1です。
どろどろとなっているのは高分子の多糖なのではないかと考えました。
ですので、ゾルあるいはゲル上になっているものを凍結させるのは
それらを結晶化?させる意味合いです。
DNAは比較的容易に水に溶解することがわかっていますので、
凍結融解を行うことは不純物のみを沈殿させることを期待しています。
ただ、糖類の場合は結構水に易溶であったりするので、この方法は
効果的でないかもしれません。

#2にもあるとおりキットがあるなら、そして予算が許すなら
そのほうが時間も短縮できていいと思いますが、キットの各段階が
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http://www.kochi-u.ac.jp/~tatukawa/edu/semc3/2001/b0sb092/92pcr4.html
http://www.gifu-u.ac.jp/~suzuki/Lecture05/PCR/PCR.html

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Aベストアンサー

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溶解度が高いんならほっとけばいいと思いますが。
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ピペットで落とすしかないんでしょうか?

また、完全に溶解したかどうかはどうやったら確認できますか?
透明になっていれば溶解したということになるんでしょうが。
沈殿自体が見えにくいのでなかなか苦労しています。

Aベストアンサー

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。

2.Mg++が存在するとDNAが非常に溶けにくい塩を作って溶けにくくなります(逆にこれを利用してEtOH沈殿の回収率を高める方法もあります)。これは純水に溶かそうとするときには難儀ですが、TEに溶かすのであればキレートされるのでそれほど問題ではありません。

沈殿を少量の溶媒に溶かすときには、タッピング(チューブの底をはじく)で、溶媒が十分な範囲をなめるようにすると良いでしょう。チューブの性質にもよりますが、沈殿が付いているところは、水はじきが悪くて液が残ります。壁に付いた液が軽くはじいただけできれいに取れるようになったら、溶けていると溶けたと思っていいでしょう。
また、おおよそ10 kb以下の小さなプラスミドならVortexを使ってもかまいません。

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真...続きを読む


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