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現在リアルタイムPCRのスタンダードを作るためにPCR産物に含まれるプライマーを除去しようとしているのですが、どうもうまくいきません。

手法としてマイクロスピンカラムS-400HR(GEヘルスケア)とPEG沈を試してみましたが、どうしても500ng/ul近くあったDNA濃度が10ng/ulあたりにまで落ちてしまいます。

スピンカラムでは回転数を800~3000×g、遠心時間を1~4分など条件をいろいろ変えて試してみました。

PEG沈では上清を捨てる際沈澱も流してしまったのではないかと思い(沈澱は見えていませんでした)、エタ沈メイトで沈殿の位置を可視化して注意深く操作してみましたが結果は同じでした。

ちなみに扱っているDNAはβ-actinの部分的配列など、どれも150~200bp程度です。
DNAの長さに問題があるのかとも考え、500bpぐらいのを使ってスピンカラムとPEG沈をやってみましたがだめでした。



やはり自分に技術的な問題があるのでしょうか・・・。
どなたかご教授お願いします。

A 回答 (3件)

補足ありがとうございました。



一点気になったのですがPCR後の産物を,そのまま吸光測定したものと
精製後に吸光測定したものを比較していないでしょうか?

PCR後の産物はprimerや反応しなかったdNTPs由来の吸光もありますので
産物だけを精製したものは見かけ上吸光度が大きく落ちます。

他の回答者様も仰るとおり
アガロースでもPAGEでも構わないので一度泳動して
濃度の見積もりと精製をすることをお勧めします。
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この回答へのお礼

RNase_Pさんが仰る比較をまさにしていました!
たしかにプライマーやdNTPは過剰に入っていますし、正確な測定はできないのですね・・・。
やはりカラムとPEG沈はうまくいかないので、ゲルの切り出しをやってみたいと思います!
どうもありがとうございました!

お礼日時:2009/05/14 23:46

PEG沈等のプロトコルについては詳細もきかずに無責任なことをいうのは何なので、なんとなくアドバイス的なものを。



わたしの場合、リアルタイムのスタンダードはサブマリン電気泳動と切り出しで作っていました。目的断片のみなら一番確実かと。PEG沈やカラムだと鋳型が残りますしね。

あと、カラムも使ったことありますが、回収10%以下は方法の問題ではないと思います。取り説どおりやれば、ほぼ全て回収できるはずですよね。PEG沈はプロトコルが問題かもしれませんがカラムも総量が減るというのは実験の方法以外に問題がある気がします。

NanoDropは使った事ないのですが、スペクトルではなく電気泳動の光量で調べて見るのもいいも知れません。機械の問題とか試薬の阻害により、正確に測れていない可能性もありますから。

というわけで、切り出しによる精製と、PEGやカラムの精製後に電気泳動を行ってみるのがいいかと思います。
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この回答へのお礼

カラムは何人か周りの人がやっても駄目だったのでカラム自体に問題があるのかもしれません・・・。
またPEGで捨てた上清を電気泳動にかけてみたところバンドが検出され沈殿していないことがわかりました。(誤って流してしまった可能性もありますが、理由についてはまだよく分かっていません・・・)
総合して考えるとゲルの切り出しが一番良い方法に思えました。
どうもありがとうございました!

お礼日時:2009/05/14 23:33

後は限外濾過などの方法もあります。


どの手法をとるにしろ
総量の減少は避けられません。
質問には濃度しか書いてありませんが
総量はどのくらい減少しているのでしょうか?
また濃度測定はどのように行っていますか?

この回答への補足

失礼しました。
濃度測定はNanoDropを使って測定しています。
溶液が25ulあったので総量は10ugぐらい減っていると思います。

補足日時:2009/05/14 13:23
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マニュアルの方法を知っている方教えていただけないでしょうか。
ハイスループットなのでゲル切り出し以外の方法を知っている方お願いいたします。

Aベストアンサー

わたしが良くやるのは
Microspin (Amersham)ゲルろ過スピンカラム
http://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=542&goods_name=MicroSpin+Columns+%3C%21%2D%2D+2+%2D%2D%3E
Qiaquick (Qiagen)イオン交換スピンカラム
http://www1.qiagen.com/Products/DnaCleanup/PcrCleanup.aspx
です。
ゲルろ過のほうが、washが必要ないだけ手間がかかりません。
一検体あたり100から150円というところでしょうか。

同僚で、PEG/NaCl沈殿でプライマー除去して、Seqしているひとがいます。
プラスミド精製のとき、RNAを上清中に除去する方法の応用です。
エタ沈では、プライマーもかなり沈殿してしまいます。

ExoSAP-ITという試薬を利用する手もあります。
http://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=574
PCR産物中のプライマーをExoIIIで分解し、
フリーのヌクレオチドをシュリンプアルフォスで脱リン酸し、
そのままSeqに持っていけるというものです。
楽ですけど、コストは上記のカラムなみです。

わたしが良くやるのは
Microspin (Amersham)ゲルろ過スピンカラム
http://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=542&goods_name=MicroSpin+Columns+%3C%21%2D%2D+2+%2D%2D%3E
Qiaquick (Qiagen)イオン交換スピンカラム
http://www1.qiagen.com/Products/DnaCleanup/PcrCleanup.aspx
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Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
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70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
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30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

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こんにちは。

実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa(配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね)が5個なので、鋳型はA型が3に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、1:1ではなく、2:1とか4:1の定量性を見るのは難しいかと思います。

ダイレクトシーケンスは、増えたPCR産物をそのまま読むために、鋳型のある塩基が----taatGc----と----taatCc----が1:1で含まれているとき(ヒトゲノムでは父方と母方の塩基が違うことがよくあります)、次のようなメリットが考えられます。
・(メリット)そのシーケンスの波形はGとCが一対一で出てくるように定量性がややあること
・(メリット)シーケンシング反応はたまにエラーを起こしますが、それはマイノリティになります。正しい配列の波形の方が大きく出るので、鋳型の配列にほぼ一致した配列が読めます。

クローニング済みのシーケンスは、1クローンだけ読むと、その配列がシーケンシング反応によるエラーの塩基置換を含む危険性が高い一方で、
・一見、単一の産物に見えても1塩基レベル、あるいは全体にわたって複数の産物がPCRで増幅されたときに、複数のクローンをシーケンスすることでなにが増えたか調べられます。ダイレクトシーケンスではこれは難しいです。
・(先の方も書かれていますが)基本的には単一のプラスミドの配列を読むため、シーケンスがきれいに読めるはずですし、その後の応用(発現用のベクターに入れる)にはプラスミドでの塩基配列の正しさの確認が必要です。

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あと、ご存じと思いますが、シーケンス反応に持ち込むプラスミドとPCR産物の至適な量が違うので、そこの確認をされても良いかと。

また、制限酵素処理の代わりに、拾われたプラスミドを一度50uLのLBに移して、そのうちの1uLを鋳型にコロニーPCRなどでインサートの有無を確認して、インサートの入ったものだけを増やすとたくさんのコロニーをカルチャーしなくて済みます。

がんばってくださいね!

こんにちは。

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Qエチジウムブロマイドについて

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結果に関して:
定電圧: 高分子側の移動が早い。低分子側の移動が遅い。
定電流: 上記の逆。

 どちらも、一長一短で、使用する泳動槽、扱うタンパク質によって、これらを使い分けるのが賢明かと思います。

(参考:電気泳動なるほQ&A 大藤道衛 編 羊土社)


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