自分の研究室では大腸菌によるタンパクの大量発現の際の菌体破砕処理をする前に、-80度で一旦凍結させます。そうした方が破砕されやすいからと、説明をうけたのですが、なぜ破砕されやすくなるのでしょうか??
凍結させることによって大腸菌の細胞膜がもろくなるということなのでしょうか??

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A 回答 (1件)

DNAなど、凍結融解を繰り返すとニックが入るとか聞いたことありませんか?


そんなのと同じ理由です。
水は4度のとき体積が最小で0度になると体積が増えます。
よって、冷やす過程で4度になった水が大腸菌の内外に漂って後に、体積が大きな氷が出現することになるのです。
まるで、一斉に風船が膨らむように大腸菌の内外に氷が出現するのです。
その時に大腸菌の構造をちょっと壊すという理屈だと思います。

本当に効いているかは、わかりませんが・・・。
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この回答へのお礼

なるほど!
よく分りました。
ありがとうございました

お礼日時:2009/05/16 21:15

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●超音波式骨密度測定装置:CM-100

古野電気株式会社(開発・製造)←魚群探知機で有名
〒662-8580 西宮市芦原町9-52
TEL0798-63-1100 FAX0798-63-0794
エルクコーポレーション(販売)
Tel.06-6942-0691

値段はあってないようなものであるのがこの業界の常識です(笑)個別にお問い合わせください。

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 ここで大腸菌の壊れている状態について確認させて下さい。
(1)超音波破砕をすると菌体も壊れるのですよね?
(2)ペリプラズムだけを壊すのには、透圧ショックが適切ですよね?
(3)超音波破砕した後、遠心した上清を回収したことは、ペリプラズム&菌体内全部における可溶性の高いタンパクの回収したことになるのでしょうか?
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大変こんがらがってしまいました。どなたか、よろしくお願いします。

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(1)超音波破砕をすると菌体も壊れるのですよね?
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(1)そうだと思います。何でもかんでも壊していることになると思います。

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お大事に。

Q大腸菌でタンパク質の発現

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pColdを使用しているということは、培養は低温なのですね。

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どの条件で試すのが一番良いのかは、わかりませんが、ある程度培養条件を変えてもだめな場合は、菌の破砕条件を変えるのも一つの方法です。

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後、これはプロのエステシャンに聞いた話ですが、超音波って実は恐いと言ってました。
しかも、もともと顔に使ってはいけないって。 
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私は顔が太りやすいので、超音波美顔機を使ってみて、これは!と感動したのですが、 そういわれるとなんか恐くて買えません。

なにかご存知の方、ご意見お聞かせください。

Aベストアンサー

google で 「教えて美顔器」 と入れると、美顔器の

高周波が体に与える影響についての質問に答えいる掲

示板がありましたよ!!

ちなみに私は、大手電気メーカの美顔器を一年程使って

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Q大腸菌での組換え蛋白質の発現

分子量約100kの蛋白質をHis-tagとの融合タンパク質として
大腸菌に作らせていますが、封入体に入ってしまっているようです。
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ちゃんとしてるにこした事はないと思っています。
こうゆう場合、本などを見ると、

低温で培養してみる
GST等とのfusionに変えてみる
ドメインごとに発現させる

等のことが書いてありますが、下2つは結構大変ですよね。
以上のような可溶化条件の検討に努力を費やしたほうが良いのか
それとも、尿素やグアニジン塩酸のようなもので
強引に可溶化して、リフォールディングに努力を費やした方が良いのか
教えてください。
 

Aベストアンサー

大腸菌での発現はやってみないとわからない....
というのがホントのところだと思います。
お手軽でいいんですけどねぇ。。。

以下は回答ではなく私だったら....
という提案ですので参考までに。

分子量が100kということですので、フルで発現させると
可溶性画分で回収するのは難しいのではないかと感じます。
なので、尿素やグアニジン塩酸で可溶化して、
リフォールディングを行ないつつ、
低温での培養やドメインごとの発現を同時進行します。

もしかしたら、大腸菌以外の発現系だと
あっさりといくのかもしれませんね(笑)。


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