自分の研究室では大腸菌によるタンパクの大量発現の際の菌体破砕処理をする前に、-80度で一旦凍結させます。そうした方が破砕されやすいからと、説明をうけたのですが、なぜ破砕されやすくなるのでしょうか??
凍結させることによって大腸菌の細胞膜がもろくなるということなのでしょうか??

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A 回答 (1件)

DNAなど、凍結融解を繰り返すとニックが入るとか聞いたことありませんか?


そんなのと同じ理由です。
水は4度のとき体積が最小で0度になると体積が増えます。
よって、冷やす過程で4度になった水が大腸菌の内外に漂って後に、体積が大きな氷が出現することになるのです。
まるで、一斉に風船が膨らむように大腸菌の内外に氷が出現するのです。
その時に大腸菌の構造をちょっと壊すという理屈だと思います。

本当に効いているかは、わかりませんが・・・。
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この回答へのお礼

なるほど!
よく分りました。
ありがとうございました

お礼日時:2009/05/16 21:15

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Q大腸菌の超音波破砕について

大腸菌でタンパクを発現させ、超音波破砕をし、遠心して上清を回収することで、目的のタンパク質を回収する方法があります。目的のタンパクは、GSTなどの可溶性の高いタンパクを結合させることによりペリプラズム間に移行させます。
 ここで大腸菌の壊れている状態について確認させて下さい。
(1)超音波破砕をすると菌体も壊れるのですよね?
(2)ペリプラズムだけを壊すのには、透圧ショックが適切ですよね?
(3)超音波破砕した後、遠心した上清を回収したことは、ペリプラズム&菌体内全部における可溶性の高いタンパクの回収したことになるのでしょうか?
 また、上記の遠心後のペレットの方も上清画分と同様に、SDS-PAGEを行いました。ペレットにはかなり様々なバンドが濃く見えました。
(4)SDS-PAGEをすると菌体は全体が壊れると思いますが、これはSDS-PAGEにおいて泳動する前に、サンプルにSDSを入れてboilする過程において菌体が破裂するのですよね?
(5)界面活性剤(SDS)を加えただけでは、菌体は破壊できませんよね?(6)界面活性剤でペリプラズムのみ壊せているのでしょうか?
 長くなりすみません。菌体が全部壊れているのか、ペリプラズムだけ壊れているのかよく分からなくなってしまったのです。
(7)最後に、凍結粉砕という方法もありますが、こちらも菌体全部壊れますよね?
大変こんがらがってしまいました。どなたか、よろしくお願いします。

大腸菌でタンパクを発現させ、超音波破砕をし、遠心して上清を回収することで、目的のタンパク質を回収する方法があります。目的のタンパクは、GSTなどの可溶性の高いタンパクを結合させることによりペリプラズム間に移行させます。
 ここで大腸菌の壊れている状態について確認させて下さい。
(1)超音波破砕をすると菌体も壊れるのですよね?
(2)ペリプラズムだけを壊すのには、透圧ショックが適切ですよね?
(3)超音波破砕した後、遠心した上清を回収したことは、ペリプラズム&菌体内全部における可溶性の...続きを読む

Aベストアンサー

(1)そうだと思います。何でもかんでも壊していることになると思います。

(2)大腸菌を浸透圧ショックで壊す方法を、私は今まで見たことがありません。っていうか、真水でも浸透圧で壊れないのでは?

(3)そうだと思います。そもそも、(1)でもそうですが、超音波では、大腸菌の何をどこまで壊すという微妙な操作は難しすぎると思います。

(4)いいえ。そもそも室温のSDS溶液でも溶けます(低温すぎて析出している場合はだめな気がしますが)。ボイルは完全に溶かす念のためです。

(5)いいえ。壊れます。

(6)いいえ。おそらく全部壊れていると思います。
大腸菌からプラスミドを抽出したことはありますか?それならばわかると思いますが、
プラスミドを抽出するときに大腸菌を壊す作業があるのですが、
用いる溶液にはSDSが入っています。
このとき、ボイルしなくても溶けてしまいます。

Qタンパク質発現誘導について

大腸菌を用いての発現誘導の際にpick upしたコロニーを2×YT(+amp)につけovernightし、さらに2×YT(+amp)を加えていて、これは薄めるためにしているらしいのですが、どうして薄めるのでしょうか?

あと、そのあとにIPTGとゆう試薬を加えていて、この試薬の正体がわからないために、なんのためにこれをいれてるのかがわからなくて困っています。

どうかよろしくお願いします。

Aベストアンサー

 大腸菌はある程度増殖し細胞の密度が増してくると増殖を止めてしまいます。そのときに細胞内の状態も停止してしまいますので、タンパク合成もストップしてしまいます。そこで密度を低くして、つまり薄めることで増殖を再開させ増殖期、まあがんがん増え始めたら遺伝子発現の誘導を行って、目的のタンパク質を作らせるという為にわざわざ行っています。私が指導するとすると、朝からコロニーを培養し増殖期に入るのをまって誘導をかけるほうを選択します。どちらでもたいてい全く問題ありません。時々癖のあるタンパク質やplasmidがあって、その場合はコロニーから直接でないとampがすぐに弱ってしまって、plasmidを持たない大腸菌が大部分になってタンパク合成できない場合もありますが、Over nightで培養できる点、大腸菌の濃度が液体として薄められるので予想が立てられやすい点など、質問にあるprotocolを使う場合も少なくありません。実際には、朝9時ぐらいからある程度暖めた培地にコロニーを植えて始めれば数リットルであれば昼過ぎには(大腸菌の株によりますが)増殖期に入り始めます。あとはどのタイミングで誘導をかけるかですが、それは目的のタンパク質によります。本当はいろいろ条件決めが必要です。そうですね。。。だいたいOD600nm=0.4から0.8程度を目安にしますが、やはりODの測定器にもよりますし、もちろん目的のタンパク質、培養温度、浸透速度、培地(pHや成分など)に大きく左右されますので、あくまで目安です。
さてIPTGですが先ほどから述べていた誘導をかける試薬です。イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドの略で様々な細菌におけるβ-ガラクトシダーゼ活性のインデューサーとして機能します。この場合ですが、大腸菌内に取り込まれラクトース類似体として機能します。具体的にはIPTGが大腸菌内のlacレプレッサーと結合することでlacオペロンをもった遺伝子に対する抑制を解除します。今回の場合は遺伝子導入されたplasmidにそれがあります。
まずはprotocolどうおりにやって目的のタンパク質が誘導されていなかったり、とっても少なかったりすれば条件をいろいろと振ってみるしか無いです。うまくいかないと大変な実験ですが、精製したタンパク質をモテるということは実験に幅が広がりますので、是非がんばってください。

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Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Q大腸菌にタンパクを作らせる

大腸菌に、あるタンパク質(cDNAは手元にある)を作らせたいのですが、どうやったらいいですか?
先生は「Ca溶液の中で大腸菌を洗って、氷の上において、それからああしてこうして、42℃におく」とかおっしゃってたのですが、これはDNAをどうやって組み込んでいるのでしょう?
また、たくさん発現させるには、どうしたらいいですか?

Aベストアンサー

ステップ1:発現プラスミドの作成
 大腸菌発現用ベクターが発売されていますので、ベクターの特定の領域(クローニングサイト)にcDNA(インサート)をいれる。
 インサートは、あらかじめPCRでつくる際にcDNAの両端(開始コドンの前と終止コドンの後ろ)に制限酵素部位をつくり、PCR後に制限酵素で切る。使う制限酵素はインサート中に切断部位がないものを使う。
 インサートと同じ制限酵素またはつなぎ目が同じ制限酵素(例:BamHIとBglII、SalIとXhoI、SmaIとEcoRVなど)でベクターのクローニングサイトを切り、インサートを入れる(ライゲーション)。
ステップ2:大腸菌で目的の発現用プラスミドを増やす
 XL1-BlueやDH5αなどの大腸菌を、先生がおっしゃったカルシウム法で処理(以下)し、ライゲーション反応終了液を加える。
<カルシウム法>
大腸菌(XL1-BlueやDH5αなど)を液体培地で一晩培養 → 液体培地で50~100倍に希釈し、一部をとって吸光度計で600nmの波長で計り、0.4~0.5位になるまで培養 → 遠心で集菌し、50~100mMの塩化カルシウムに懸濁、氷中で10分置く → 遠心し、大腸菌の沈殿に、集菌した培地量の1/10~1/20量の塩化カルシウム(同上)に懸濁 → 氷中に数時間置くと、プラスミドの導入効率が上がるが、すぐに使ってもよい → 100μlの大腸菌(塩化カルシウム中)にライゲーション反応終了液(最大10μl)を加え、氷上で30分 → 恒温水槽かヒートブロックを使い、42℃、45~90秒間熱ショックを与える → 氷に戻し2分置く → 900μlの培地を加え、37℃、1時間 → 一部(最大200μl)をプレート(プラスミドの薬剤耐性に注意して抗生物質を含む寒天培地)にまく → 37℃で一晩(16時間前後)置くと、コロニーが現れている
ステップ3:発現プラスミド回収
 コロニーをいくつかピックアップしてそれぞれ適した抗生物質を含む液体培地で一晩培養 → マニュアル法や簡便なキットを用いた方法でプラスミドを回収 → ただしくインサートが入っているか、プラスミドの一部を制限酵素で切ったり、塩基配列を調べたりする
ステップ4:発現
 タンパク質発現用の大腸菌(ベクターに合わせていろいろあります)を塩化カルシウム法で処理(ステップ2と同じ方法)でインサートが正しく入っていたプラスミドを1~10ng導入する

発現プラスミドは、ほとんどがある試薬によりインサートのタンパク質発現を誘導させるようになっていますので、それについて述べます。なぜ誘導するようになっているかというと、大腸菌にとって自分のもの以外のタンパク質を発現することはかなりの負担で、タンパク質の中には大腸菌にとって悪い影響を与える場合が多いからです。誘導に使う試薬で最も頻繁に使われるのはIPTGとよばれるものです。

 発現プラスミドを導入した発現用大腸菌コロニーをピックアップして適した抗生物質を含む液体培地で一晩培養 → 同じ培地で20~100倍に希釈して培養し、一部をとって吸光度計で600nmの波長で計り、0.5~1.0位になるまで培養 → 0.1~1.0mMIPTGを加え更に培養 → 1時間後、2時間後、...、12時間後など、いくつかの時点で一部を取ってSDS-PAGEという分析法を行います。これにより、目的のタンパク質が十分にできているかいないかがわかります。

 ご質問に、「たくさん発現させるには、どうしたらいいですか?」とありますが、発現プラスミド(ベクター)と、インサートと、大腸菌株の間で相性がりまして、たくさん発現するものから全く発現しないものまであります。経験者は試行錯誤しながらやっています。

ステップ1:発現プラスミドの作成
 大腸菌発現用ベクターが発売されていますので、ベクターの特定の領域(クローニングサイト)にcDNA(インサート)をいれる。
 インサートは、あらかじめPCRでつくる際にcDNAの両端(開始コドンの前と終止コドンの後ろ)に制限酵素部位をつくり、PCR後に制限酵素で切る。使う制限酵素はインサート中に切断部位がないものを使う。
 インサートと同じ制限酵素またはつなぎ目が同じ制限酵素(例:BamHIとBglII、SalIとXhoI、SmaIとEc...続きを読む

Q不溶性蛋白の可溶化(組み換え蛋白の発現)

いつもお世話になっております。

組み換え蛋白をGST融合蛋白として発現させる系をおこなっております。
目的の蛋白が不溶姓にでてくるのですが、これを可溶化させるために次の方法を考えております。

1、界面活性剤を用いて再可溶化
2,cold発現ベクターでの発現

これ以外にこうやったら可溶化したよ、という方いらっしゃいましたらお教えいただけたら幸いです。

最初の可溶化はPBSにリゾチームを添加したもので凍結融解を10回くりかえして行っています。

Aベストアンサー

融合タンパク質をどのような目的で使うかによっても、好みが違ってくると思います。
私はこれまで収量重視の実験が多かったものですから、不溶性になってもあまり気にせず、目一杯発現誘導していました。しかし、Pull-down assayやGel-shiftのような実験をやっていた同僚たちは、たとえ収量を犠牲にしても、最初から可溶性になるように発現させる方法を選んでいました。たとえば、低温で発現誘導する、Periplasmに分泌されるとかthioredoxinと融合させるとかの宿主/ベクター系を使うなどです。

不溶化してInclusion bodyを形成してしまい可溶化する必要がある場合私はこうしています(出典はMolecular Cloningだったと思います)。
1. Inclusion bodyを蒸留水、またはPBSなどにピペッティングなどで懸濁、遠心。1~3回繰り返し可溶性成分を洗い落とす。

2. 沈殿に少量の10 mM EDTA (pH8)を加える(1L培養につき2 mL程度)

3. 等容量の8 M尿素を加え、30分間ステア。溶けがわるいようなら、さらに8 M尿素を加える。ここでTx100, Tween20などの界面活性剤、DTT、適当なpHのバッファーなどを加えると効果的な場合がある。

4. 遠心して不溶物を沈殿させ、上澄みを回収。

5. 2 M 尿素/5 mM DTT/0.2 mM EDTA→PBS(数回)で透析。または、アフィニティーカラム精製で許容できる尿素濃度(タグによって異なる)まで希釈してカラム精製(カラムの中で尿素濃度が下がると、そこで不溶化するおそれあり)。

界面活性剤は、透析で取り除きにくいので、界面活性剤が用途に影響がある場合は入れない方がいいでしょう。
逆に、界面活性剤が混在していても影響がないような場合は、溶菌するのに使ってもいいと思いますよ(凍結融解は、手間でしょう)。

融合タンパク質をどのような目的で使うかによっても、好みが違ってくると思います。
私はこれまで収量重視の実験が多かったものですから、不溶性になってもあまり気にせず、目一杯発現誘導していました。しかし、Pull-down assayやGel-shiftのような実験をやっていた同僚たちは、たとえ収量を犠牲にしても、最初から可溶性になるように発現させる方法を選んでいました。たとえば、低温で発現誘導する、Periplasmに分泌されるとかthioredoxinと融合させるとかの宿主/ベクター系を使うなどです。

不溶化してInc...続きを読む

Qタンパク質の保存期間

Hisタグつきタンパク質をNiキレートカラムで精製し、
イミダゾールで溶出したのですが、
そのまま4℃で保存する場合、イミダゾール溶液中ではタンパクはどれくらいの期間安定に保存できるものでしょうか?
タンパク精製に不慣れなため、ご回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

ご質問の回答としては、目的たんぱく質によって異なる。としか答えようがないのが現実です。
酵素蛋白などは4℃で3日ほど置いておけば失活してしまうものもありますし、室温にほっておいても大丈夫なものもあります。
溶出に用いたイミダゾール溶液のバッファー組成(グリセロールや界面活性剤、塩の濃度など)によっても保存安定性は変わってきます。
一般的なたんぱく質で考えると、4℃で1-2週間なら大丈夫だと思いますが。
私も精製蛋白を扱っていますが、
小分けして-80℃で保存し、凍結-再融解をさけるため、小出しにして使い捨てにしています。

QDNAとゲノムDNAの違い

DNAとゲノムDNAの違いを教えてください。
遺伝子とDNAの違いはわかるのですが、上記の2つについてはわかりません。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

ゲノム
http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%B2%E3%83%8E%E3%83%A0

DNA
http://ja.wikipedia.org/wiki/DNA
DNAは化学的な物質名で人口に合成した化学物質でも、その化学的構造を持っていればDNAといいます。

ゲノムDNAの定義はよく分かりませんが、真核生物などはミトコンドリアなどにもDNAがあり、それと区別してゲノムDNAといえるかもしれません。また、ウイルスが感染しいて、染色体以外にDNAが存在する時、両者を区別するのにそういう表現ができると思います。

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

Q抗原抗体反応について

ウエスタンブロット法による特異的たんぱく質の検出反応を先日行ったのですが、一次抗体、二次抗体をもちいて反応を行いました。

抗体抗原反応を行う上で免疫応答反応の理論を用いて検出しているのはわかりますが、なぜ二次抗体を使う必要があるのでしょうか?

自分の考えでは、一次抗体だけでは免疫応答反応をすることができるが、どこの特異的たんぱく質と反応しているかをより明確にするために二次抗体に発色するたんぱく質などをつけた上で反応を見やすくしているのではないかと考えているのですが…。

詳しく教えてくださるとありがたいです。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

一次抗体は特異的たんぱく質を抗原として認識し結合します。二次抗体は一次抗体の定常部位を抗原として認識し結合します。ポリクローナル抗体は一つの抗原たんぱく質の複数の場所に結合しますから、一次抗体と二次抗体を使うと、一次抗体の結合した場所に一次抗体よりも多くの二次抗体が結合することになります。つまり、二次抗体を使う方が特異的たんぱく質の検出感度を上げる事ができるということです。

二次抗体は酵素などで標識されていて、酵素反応によって抗体の結合した位置を知るわけですが、一次抗体に標識を行っても同じ事はできます。しかし、個々の一次抗体に標識を行うより、複数の一次抗体を認識できる二次抗体を大量生産し標識を行う方が、コストや収量などの点から見て優れています。上に書いた通り二次抗体を使う方が検出感度も上がりますから、この方法が広く使われているのです。


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