大腸菌のコンピテントセルは対数増殖期の細胞を塩化カルシウム溶液で処理することによって得られる。

という風に説明されていることが多いのですが、なぜ塩化カルシウム溶液で処理するのですか??
処理することによって大腸菌にはどのような変化が起こっているのでしょうか??

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A 回答 (1件)

大腸菌の中に、plasmidDNAが取り込まれる最初のステップに大腸菌表面にあるlipopolysaccharide(LPS) 分子とplasmid DNAが結合します。

次のステップに、LPSに結合したplasmidDNAが、細胞膜構造の変化により細胞内に移動します。この2つのステップに効いているようですが、詳しいメカニズムは分かっていないようです(Sarkar et al.,current science 2002)。

たまたま古い論文が引っかかてきたので、最新の知見が知りたいところです。
ではでは
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この回答へのお礼

論文まで紹介していただき、ありがとうございます!!
参考にさせていただきます♪

お礼日時:2009/05/23 22:30

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Q大腸菌の抗生物質の作用の違いについて

はじめまして。大学で微生物の研究をしています。
わからないことがあったので宜しければ教えてください。
大腸菌の抗生物質であるアンピシリンと、ストレプトマイシンを加えた場合では大腸菌にあらわれる変化になにか違いはあるのでしょうか?
教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

耐性のない大腸菌に対しての反応の違い、ということでよろしいでしょうか。

#2の方の補足ですが、アンピシリン(βラクタム系抗生物質)は細胞壁合成酵素阻害剤ですので、静菌的に作用します。薬剤そのものによって溶菌はしないと思いますが、細胞壁を新たに合成することができないので、増殖(や成長)はできません。菌数は増えないので、結果的に自身の代謝によるストレス物質で徐々に死滅していきます。

一方のストレプトマイシン(アミノグリコシド系抗生物質)は30Sリボソームサブユニットに不可逆的に結合し、タンパク質合成を阻害しますので、細胞の生命活動が停止し、細胞が死滅します。こちらは殺菌的に作用します。

耐性という話もでたので蛇足します。
βラクタム系抗生物質に対する耐性は、多くのグラム陰性桿菌の場合、βラクタムを特異的に加水分解するβラクタマーゼという酵素によります。したがって培地中にβラクタマーゼを産生する細胞がいた場合、その系のβラクタム剤が徐々に減っていきます。前述の通り静菌的に作用しますので、耐性を持たずβラクタムにさらされつつも耐えていた(増殖できなかった)細胞も、ある程度βラクタムがなくなったところで増え始めます。
遺伝子操作などでβラクタム系の薬剤マーカーを使った場合、プラスミドの入った目的とする大腸菌の周りに、時間が経つとプラスミドの入っていない(耐性を持たない)はずれのコロニーが増え始めます(サテライト)が、これは上記の理由からです。

一方のストレプトマイシンは殺菌的に作用しますので、サテライトは比較的できません。アミノグリコシド耐性は、アミノグリコシド修飾酵素による薬剤の不活性化、または標的部位であるリボソームサブユニットの点突然変異がよく知られています。

耐性のない大腸菌に対しての反応の違い、ということでよろしいでしょうか。

#2の方の補足ですが、アンピシリン(βラクタム系抗生物質)は細胞壁合成酵素阻害剤ですので、静菌的に作用します。薬剤そのものによって溶菌はしないと思いますが、細胞壁を新たに合成することができないので、増殖(や成長)はできません。菌数は増えないので、結果的に自身の代謝によるストレス物質で徐々に死滅していきます。

一方のストレプトマイシン(アミノグリコシド系抗生物質)は30Sリボソームサブユニットに不可逆的に...続きを読む

Q大腸菌の増殖曲線

現在、MG1655を用いて増殖曲線と生菌数の測定をしています。
テーマは増殖曲線と生菌数のグラフを方対数方眼紙にプロットし
相互関係を検討するというものなのですが、初めての実習なので
全く理解ができません。

大腸菌の増殖曲線と生菌数の相関関係についてアドバイスを頂きたく、書き込みをさせていただきました。よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

学校の実習だったら、まず先生に質問されてはどうでしょうか?

私の知識の範囲では、生菌数と時間との関係を示すのが、増殖曲線だと
理解しているので、増殖曲線と生菌数のグラフというのは、言葉からは
全く想像できません。改めて、学校で確認されるのが良いと思います。

QPCRと大腸菌クローニングの違いについて教えてください

大腸菌によるクローニングを用いた解析の流れとして,PCR-Cloning-Sequencing法があるかと思います.

シークエンスにかける前に,わざわざ大腸菌でクローニングする理由が分かりません.シークエンスにかけるため,対象DNAを増やすのであれば,そのままPCRで増やしてはダメなのでしょうか?

クローニングには対象DNAを増やす以外の何か重要な意味があるのでしょうか?(PCRにカイネティクスがある事は存じております).専門書で確認したところ,ターゲットDNAを増幅させるという意味において,広義にはPCRもクローニングの一部だと書いてありました.

すいません.素人質問で申し訳ありません.
よろしくお願い致します.

Aベストアンサー

最近のPCR用の酵素はHigh Fidelity、正確性が高くエラーは入り難いですが、PCRで酵素反応を経ただけ、エラーの確率があがります。一方、大腸菌内で増やしたものはほとんどの場合増幅によるエラーは起こりません。(条件付でいろいろな例外もありますけど)

PCR産物は得られたDNA断片の数だけ酵素反応が起こった結果の産物です。その中にはエラーの入ったものと入っていないものが混ざっています。それを鋳型にして確かに幾らでも増やせますが、状況によってはエラーが入ったものが主要成分になります。

一方、プラスミドに繋いで大腸菌に入れると、一つの細胞あたり、一個のプラスミドが増幅されます。(これも条件付ですが、最終的にそうなります)そしてシングルコロニーを拾うことをクローニングと言います。(クローニングの本来の意味と現在の適用される範囲を調べてください)

その大腸菌は欲しい配列を含んだプラスミドを維持し、増やすことが出来ます。大腸菌はグリセロールストックで半永久的に保存できます。これはプラスミドすなわち欲しい遺伝子を維持することであり、現物を大腸菌の培養のみで増幅できる状態にあります。ここには配列の情報も必要ありません。現在のように情報がどこからでも手に入る場合はこの意味が弱くなったかもしれませんが、これは今後何をするにも大変有利な状況です。

実際にPCR、ダイレクトシークエンス、ということはよくやられています。しかし、シークエンスだけがすべてではありません。

簡単に言うと便利だから、かな。

最近のPCR用の酵素はHigh Fidelity、正確性が高くエラーは入り難いですが、PCRで酵素反応を経ただけ、エラーの確率があがります。一方、大腸菌内で増やしたものはほとんどの場合増幅によるエラーは起こりません。(条件付でいろいろな例外もありますけど)

PCR産物は得られたDNA断片の数だけ酵素反応が起こった結果の産物です。その中にはエラーの入ったものと入っていないものが混ざっています。それを鋳型にして確かに幾らでも増やせますが、状況によってはエラーが入ったものが主要成分になります。

一方...続きを読む

Q病原性大腸菌の増殖について教えてください

O157などの病原性大腸菌は、適当な湿度や温度、栄養など条件がそろえば、どんどん増殖するらしいですが、その増殖する条件をひたすら保ち続けたら、菌は何年も何十年でも増え続けるのですか。

わかりにくい質問ですみません。
いちばんはじめの菌が、寿命?でたとえば1年で死んでしまっても、そこから新しく増殖した菌はまだ生きていて・・・という感じで、菌が何年たっても無くならない(絶滅しない)となり、結果的に菌が増え続け・・・ということになりますか。

また菌が何年も生き続ける、増殖しつづける環境というのは、人間が普通に生活している環境の中にも存在しますか。

Aベストアンサー

心配はいりません。
O157などの病原性大腸菌は腸内でしか増殖できません。
人間の場合は強い腹痛がありますので、周りに保菌者は
いないと考えられます。
保菌の確率があるのは牛です。
病原性大腸菌は腸内だけで食肉部には存在しないのですが、
食肉処理がいい加減だと腸の内容物がふちゃくするのです。
付着したとしても表面だけなので表面をよく焼けば大丈夫です。

ということで家の掃除は無意味です。

Q大腸菌operon(オペロン)について

あるウィルスのDNAに大腸菌オペロンのDNAが400bpぐらいマッチングしました。こういう場合、このウィルスは大腸菌と関係していると考えられますか。GC%が大腸菌と一致していたら大腸菌をもとにしたものと考えてもいいでしょうか。

Aベストアンサー

大腸菌の配列とウイルスの配列を比べて見ましたが、
少なくとも、現時点でNCBIからダウンロードしたデータでは
そのように100%一致する領域は見当たりませんでした。
(SARSの配列にヒットしたのは、類縁のウイルスのみでした。)

ただし、大腸菌のご指摘の領域には、ISという、移動性因子が
含まれていることが分かりました。
そこで、この領域に一致する配列をデータベースで検索
したところ、大腸菌以外に、ヒトやイネなどの配列と
されているもののいくつかにもヒットしました。
これは、おそらく、ヒトやイネなどの塩基配列を決定する操作において、
一旦大腸菌でそのDNAを増やす過程において、ISが大腸菌の
ゲノムから飛び出して、ヒトやイネのDNAを載せたプラスミドに
飛び込んでしまったためであると思われます。

したがって、これらの現象は、あくまで、配列決定操作上の
誤りであり、ヒトやイネがそのような配列のDNAを持っているという
ことではないでしょう。

>それで仮説ですが、大腸菌にバイオ操作でウィルスを感染させて利用するような技術はありますか?そうすれば大腸菌のDNAや部分的な機能が含まれたりするのではないでしょうか。

つまり、上記の様に、大腸菌にウイルスを感染させたという
わけではなく、ウイルスのゲノムDNA配列を決定するにあたり、
その一部分ごとにしたウイルスゲノムDNAを大腸菌内で
増幅させた際に生じた混入と見るのが妥当でしょう。
(もし、どこかの時点で取得して来たウイルスの配列に
大腸菌の配列が含まれていたとした場合)

ちなみに、動物に感染するウイルスを大腸菌に感染させることはできません。
大腸菌に感染するウイルスの仲間もいますが、それは、
バクテリオファージと言われるものであり、ヒトなどの
動物に感染するものとは全く違うものです。
鳥にしか感染しないはずのウイルスがヒトに感染するように
なってしまうという様なレベルの違いではないのです。

大腸菌の配列とウイルスの配列を比べて見ましたが、
少なくとも、現時点でNCBIからダウンロードしたデータでは
そのように100%一致する領域は見当たりませんでした。
(SARSの配列にヒットしたのは、類縁のウイルスのみでした。)

ただし、大腸菌のご指摘の領域には、ISという、移動性因子が
含まれていることが分かりました。
そこで、この領域に一致する配列をデータベースで検索
したところ、大腸菌以外に、ヒトやイネなどの配列と
されているもののいくつかにもヒットしました。
これは、おそら...続きを読む

Q大腸菌での細胞膜タンパクを可溶性画分から回収するにはどうすればよいでしょう?

約60KDaの一回膜貫通型のタンパクをBL21で発現させようと思っています.

うちの研究室はもともと遺伝子とかタンパクには縁のない研究室なので、大腸菌およびプラスミドなどを扱っている人がおらず、独学で研究しています.
ゆえに、ほとんど人に相談することもできず四苦八苦しております(汗)

目的は、タンパクの全長かつタグフリーの状態で回収することです.

現在までにGSTタグ(pGEX)で、低温(15-25 ℃)、IPTG濃度(0.1-1 mM)などで検討を行いましたが、ほとんどがinclusion bodyに入っているようで(ウエスタンブロットで確認済み)なかなか可溶性画分から目的の回収量(できれば数 mg)に至りません.(10L cultureで200 ug程度)

また、最終的にGSTタグをグルタチオンカラムに保持した状態でのプロテアーゼによる切断を行ったのですが、どうやらタンパク質の疎水性が高いためかタンパクがロストしました.というか、膜タンパクはそもそも溶けないのでしょうか?

このような状態なのですが、なにかよい解決法があれば教えて下さい.
ちなみに、inclusion bodyからのリホールディングをスモールスケールで試してみたのですが、アルギニンと酸化型グルタチオンがないと凝集が起きやすく、またコストも馬鹿にならないように感じました.
(研究テーマが研究室のメインとはややズレており、なかなか研究費が降りないため、できうる限り低コストな策があればありがたいです)

また、目的タンパクの性質(pKa、親水性?疎水性?、立体構造など)を調べる方法やソフトがあれば教えて下さい.
ちなみに、Protein Data Bankで調べてみましたが、残念ながら登録されていないようでした.

約60KDaの一回膜貫通型のタンパクをBL21で発現させようと思っています.

うちの研究室はもともと遺伝子とかタンパクには縁のない研究室なので、大腸菌およびプラスミドなどを扱っている人がおらず、独学で研究しています.
ゆえに、ほとんど人に相談することもできず四苦八苦しております(汗)

目的は、タンパクの全長かつタグフリーの状態で回収することです.

現在までにGSTタグ(pGEX)で、低温(15-25 ℃)、IPTG濃度(0.1-1 mM)などで検討を行いましたが、ほとんどがinclusion bodyに入っているよ...続きを読む

Aベストアンサー

>10L cultureで200 ug程度

大腸菌は外来膜蛋白が嫌いです。200 ug程度は上々です。うまくいかないほうが普通です。

>どうやらタンパク質の疎水性が高いためかタンパクがロストしました.というか、膜タンパクはそもそも溶けないのでしょうか?

マイルドなデタージェントは入っていますか?NP40、Triton X-100など。どこに行ってしまったか、分解してしまったかは、チューブの壁にくっついていることも考えに入れて、SDSで洗って検討できるかもしれません。

Q大腸菌について。

とても初歩的なことをお尋ねさせていただきます。

・大腸菌は、もともと人間の大腸内で増殖・生存している菌なのに、それを食べてどうして病気になるのでしょうか?

・大腸菌の中で、ガスを発生するのが病原菌と聞いたことがあるのですが、ガスとは何なのでしょうか?

・一般的な菌検査では、大腸菌群(大腸菌とは関係ない??)、ガスを発生する菌か否かで検査するのでしょうか?具体的な菌名で検査しないのは、コストがかかるからでしょうか?

・食品で病原性大腸菌が発生する要因としてどんなことがあるのでしょうか?

以上ご回答のほどよろしくお願い申し上げます。

Aベストアンサー

ご職業は何でしょうか。質問者様の立場がわかるとより状況に即した回答ができると思います。
私は医師です。
・人間側の防御機構との釣り合いの問題です。細菌が優勢になると病気になります。O-157など人間にとって強烈な毒素を産生する一部の大腸菌は人間の大腸内にいません。
・その場合のガスとはCO2やH2がメインです。ガスを出さない病原性大腸菌も多くいます。
・ガスを産生する菌は大腸菌以外にもいます。ガス産生能は、菌を推定する一つの目安になります。具体的な菌名まで特定しないのは、まあ、コストというか、需要の問題です。抗菌薬治療するならもっと細かく分類が必要です。大腸菌群とは大腸の中にいる菌という意味で、大腸菌やその他の腸内細菌を含みます。
・細菌を含む生物は基本的に自然発生しません。外からの混入、増殖を減らす努力をしてください。

Q"浮遊細胞"の細胞増殖率を、なるべく簡単に測定したいのですが、

"浮遊細胞"の細胞増殖率を、なるべく簡単に測定したいのですが、

どのような方法があるでしょうか?

Aベストアンサー

特別な設備が無いなら、一定時間ごとにサンプリングして
血球計算盤でカウントするのが一番簡単だと思いますよ。

Q大腸菌の遺伝子操作について・・・

大腸菌にプラスミドを加え形質転換させました。
最終的にLB/ampプレートに溶液をまき一日待ちました。

amp→アンピシリン(抗生物質)

大腸菌は紫外線に当てて発見できましたがこの大腸菌は最初の大腸菌と同じのができあがったと考えていいもですか?それとも違う物質なのですか?

Aベストアンサー

大腸菌をプラスミドを用いて形質転換したとき、LB/amp培地を使用したということは、そのプラスミドにはamp耐性の遺伝子が組み込まれているためです。プラスミドがうまく導入された大腸菌は(つまり、形質転換成功)amp耐性がつきますので、LB/amp培地上でも生育でき、コロニーが現れますが、プラスミドが導入されなかった大腸菌はamp耐性を持っていないため、LB/amp培地では生育できずコロニーとしては現れません。

一般的にプラスミドには抗生物質耐性の遺伝子がコードされているので、これを利用して形質転換したものとしてないものを選抜しています。最初の方のように大腸菌がもともとamp耐性を持っているとすれば、話は変わってきますが・・・。

質問の内容を見るとおそらく研究している方ではなく、大学の授業の課題のように思えます。だとすると、紫外線を当てたのは形質転換体とそうでないものを選抜する目的ではなく、形質転換後の大腸菌がどのように変わったのか(この場合、紫外線に反応する大腸菌を作出したのでは?かなり有名な遺伝子です)を見るためだと思います。

分子生物学を専攻に研究されている方にとっては、この問題はかなり基本の部分になりますが、実際に自分で体験しないと本で読むだけでは理解するのに時間がかかるのかもしれないです。今後分子生物学の分野の授業をとるとか、そちらのほうに興味があるのでしたら、本格的なものでなくても載っていると思うので、生化学の教科書等でプラスミドや形質転換について勉強されると良いですよ。

大腸菌をプラスミドを用いて形質転換したとき、LB/amp培地を使用したということは、そのプラスミドにはamp耐性の遺伝子が組み込まれているためです。プラスミドがうまく導入された大腸菌は(つまり、形質転換成功)amp耐性がつきますので、LB/amp培地上でも生育でき、コロニーが現れますが、プラスミドが導入されなかった大腸菌はamp耐性を持っていないため、LB/amp培地では生育できずコロニーとしては現れません。

一般的にプラスミドには抗生物質耐性の遺伝子がコードされているので...続きを読む

Q大腸菌の超音波破砕処理について

自分の研究室では大腸菌によるタンパクの大量発現の際の菌体破砕処理をする前に、-80度で一旦凍結させます。そうした方が破砕されやすいからと、説明をうけたのですが、なぜ破砕されやすくなるのでしょうか??
凍結させることによって大腸菌の細胞膜がもろくなるということなのでしょうか??

Aベストアンサー

DNAなど、凍結融解を繰り返すとニックが入るとか聞いたことありませんか?
そんなのと同じ理由です。
水は4度のとき体積が最小で0度になると体積が増えます。
よって、冷やす過程で4度になった水が大腸菌の内外に漂って後に、体積が大きな氷が出現することになるのです。
まるで、一斉に風船が膨らむように大腸菌の内外に氷が出現するのです。
その時に大腸菌の構造をちょっと壊すという理屈だと思います。

本当に効いているかは、わかりませんが・・・。


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