大腸菌のコンピテントセルは対数増殖期の細胞を塩化カルシウム溶液で処理することによって得られる。

という風に説明されていることが多いのですが、なぜ塩化カルシウム溶液で処理するのですか??
処理することによって大腸菌にはどのような変化が起こっているのでしょうか??

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A 回答 (1件)

大腸菌の中に、plasmidDNAが取り込まれる最初のステップに大腸菌表面にあるlipopolysaccharide(LPS) 分子とplasmid DNAが結合します。

次のステップに、LPSに結合したplasmidDNAが、細胞膜構造の変化により細胞内に移動します。この2つのステップに効いているようですが、詳しいメカニズムは分かっていないようです(Sarkar et al.,current science 2002)。

たまたま古い論文が引っかかてきたので、最新の知見が知りたいところです。
ではでは
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この回答へのお礼

論文まで紹介していただき、ありがとうございます!!
参考にさせていただきます♪

お礼日時:2009/05/23 22:30

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QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Qコンピテントセル作製で

この時使用するTB bufferの中には、大抵塩化マンガンが含まれていますが、何故塩化マンガンが必要なのでしょうか?
通常、塩化カルシウム法を用いる場合、TB bufferを使用せず、塩化カルシウム溶液だけでもコンピテントセルの作製が可能とのことですので、塩化マンガンをわざわざ添加するということは、私なりに疑問に感じています。
どなたかご存じの方、よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

Hanahanを始め先人たちが、いかにすればプラスミド導入効率を高くできるか、いろいろ条件を検討した経験則としか言いようがないのではないでしょうか。そもそもMnに限らず、CaにしろRbにしろ、どのようなメカニズムで大腸菌にcompetenceを与えるのかも、はっきりとはわかっていないのですから(一説によると、大腸菌表面のリポポリサッカライドとDNAをくっつけるのに二価金属イオンが効いているのだとか)。
http://www.ias.ac.in/currsci/dec102002/1376.pdf

20年ほど前には、私もCaCl2だけで形質転換をしていました。確かにできます。でも、後々一般化した様々な改良法に比べると、形質転換効率やcompetenceの安定性、保存性は比べものにならないほど悪いですよ(たとえば、作ったcompetent cellはその日の内しか使い物にならない、凍結保存すると形質転換効率ゼロとか)。

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

Qヒートショックをするのには何か意味があるのでしょうか??

コンピテントセルにプラスミドDNAを取り込む実験をしていますが、極端に冷却した後、ヒートショックという過程があることをしりました。
ヒートショックをすることには、何か意味があるのでしょうか??
コンピテントセルが脆くなってDNAがさらに取り込まれやすくなったりとかするのでしょうか??

Aベストアンサー

基本的な思い違いをなされていると思います。ヒートショックによりプラスミドがコンピテントセル内に取り込まれるんです。そのため、その前段階のメルカプト添加や冷却などはコンピテントセル表面にプラスミドをくっつけヒートショックにより取り込ませやすくするための前準備という考え方が正しいです。
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Qヒートショック法について

化学のカテゴリーに同様の質問をさせて頂いたのですが、もしやカテゴリー違いなのでは、と思いこちらのカテゴリーにも質問させて頂きました。

質問は、タイトルどおりです。
コンピテントセルに蛍光性タンパク質ベクターを、ヒートショック法を用いて導入しました。
このヒートショック法の機構とかいったものについて語れる方、ご教授願いたいです。

また、今回原核細胞についてヒートショック法を行ったのですが、この方法は真核細胞には適用できませんよね?そこらへんの確認と、その理由をお教え願いたいです。

Aベストアンサー

大腸菌に対しての42℃のheat shockの原理は本当のところちゃんとわかっていないじゃないでしょうか。plasmidを取り込むだけであれば、このショックは必要としません。37℃でやるヒトもいるぐらいです。
現在のようにコンピテンシーの高いコンピテントセルを作る方法論が確立されてからは、あまり重要視されていないステップかもしれません。
都市伝説に近いですが、マラリアだったか、何らかの菌は凍結保存すると休眠状態でプレートに撒いても生えてこないが、熱ショックをかけると増殖が開始するという実験方法から派生して凍結保存しているコンピテントセルにplasmidを取り込ませてから、熱をかけて刺激するという方法が採られているという説もあります。
文面から察するに温度をかけることでplasmidが取り込まれるのならば、真核培養細胞でも同様の方法はあり得るかという意味かと思いましたが、実際に大腸菌でもメンブレンをplasmidが通過するためにいろいろと工夫がなされています。どの細胞にも共通で使用される方法といえば、あえて言うなら電気穿孔法つまりエレクトロポレーション法でしょうか。
ご参考になれば幸いです。

大腸菌に対しての42℃のheat shockの原理は本当のところちゃんとわかっていないじゃないでしょうか。plasmidを取り込むだけであれば、このショックは必要としません。37℃でやるヒトもいるぐらいです。
現在のようにコンピテンシーの高いコンピテントセルを作る方法論が確立されてからは、あまり重要視されていないステップかもしれません。
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Qコンピテントセルの作製において・・

コンピテントセルを作る時、効率の良いものをつくるため(最低でもx10の7乗)懸濁する際やエッペンに分注する時には低温室で作業すると初めに習ったのでそうしているのですが、長時間4℃にいるのはかなりきついし精神的にもしんどいです。

できたら普通の部屋で氷上で冷やしながら作業したいのですが、低温室でやらなくても効率の良くなるコツとか分かる方いましたらご教授ください。

Aベストアンサー

私達の研究室でも塩化カルシウム法で作っていたのですが、効率が上がらなかったので塩化ルビジウム法という方法に代えました。私の場合、塩化カルシウム法に比べ、効率が100倍から1000倍くらいに上がりました。うちの研究室ではJM109の場合、誰がやっても10^7をきることはなくなりましたね。

参考URL:http://www.gene.mie-u.ac.jp/Protocol/Original/Transform-Comp-Cell-Freeze.html

QアルカリSDS法におけるDNAとプラスミドの分離について

大学生になり、生物実験でアルカリSDSを行っている者です。
アルカリSDSによるゲノムDNAとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは1本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、とありました。そしてボルテックスはsolutionIIを加えた以降は禁止で転倒混和ですが、これは激しいボルテックスによりゲノムDNAも粉々になって上清画分に出てきてしまうため、また、膜にゲノムDNAは結合していて膜とともに沈殿させることができるが、DNAが細かく切れると膜とともに沈殿させることができないため、という文もありました。疑問に思うことは以下の6つです。

(1)一本鎖になるとニックが入りやすくなるのに、プラスミドは二本鎖に戻し、ゲノムDNAを一本鎖のままにすることが、ボルテックスなどでゲノムDNAが細かくなるのを防ぎたいということと矛盾している気がします。細かくなると不都合になるのになぜわざわざ一本鎖にするのでしょうか?
(2)その後のエタ沈でDNAを沈殿させますが、一本鎖のほうが二本鎖より沈殿させやすいのしょうか?原理的にはDNAはエタノールに不溶性なため沈殿することを考えると、一本鎖でも二本鎖でも不溶性なことには違いがありませんよね?一本鎖の方がもつれて絡まりやすいから凝集するのでしょうか?
(3)ゲノムDNAは菌体の膜に結合していて一緒に沈殿しやすいというイメージがよく分からないのですが、膜に所々DNAが細胞骨格などとともに結合しているのでしょうか?何かのタンパクを介しているのでしょうか?
(4)solitionIでTris-HCl(pH.8.0)などの緩衝液を加え、菌体をボルテックスして懸濁する必要があるのは後のsolutionII以降の操作のためにどのような目的がありのでしょうか?EDTAでDNaseなどを不活性化するのは分かるのですが…。またグルコースも加えるのは何のためなのでしょう。Tris-HClで十分緩衝液になっている気がします。
(5)エタ沈の前に、フェノールクロロホルム抽出をはさむプロトコールがありました。フェノールクロロホルム抽出をはさまなくても、solutionIIのアルカリ性でタンパクは変性し、不溶性となるので、核酸と分離できるはずですが、はさむ方法もあるのは、よりタンパクを取り除くためでしょうか?
(6)こちらは、確認質問なのですが、エタ沈の目的は核酸の沈殿であって、タンパクとの分離はできませんよね?

ちまちまとすみませんが、どなたかよろしくお願いします。

大学生になり、生物実験でアルカリSDSを行っている者です。
アルカリSDSによるゲノムDNAとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは1本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、...続きを読む

Aベストアンサー

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、それを防ぐ為に穏やかな条件で回収しているのではないでしょうか。

(2)これはエタノール沈殿の条件では、一本鎖、二本鎖に違いはあまりないと思います。

(3)細胞質中で膜結合性タンパク質との巨大複合体として存在していると言われています。sol3の後の遠心で一緒に巻き込まれて沈殿する、というようなイメージではないでしょうか。

(4)EDTA等は、仰るようにDNAの安定化の為だと思います。
グルコースは浸透圧のコントロールとして、また後のエタノール沈殿のときにはDNAの共沈剤の効果があると言われています。浸透圧のコントロールとして塩を加えてもよいのですが、塩はDNAと不溶性複合体をつくりますので、最近のプロトコルはglucoseみたいですね(私が学生の頃はEDTA以外特になにも入っていませんでした)。後者はエタ沈の時にグリコーゲンを加える事があるのと一緒ではないでしょうか。

(5)仰るようにタンパク質を完全に除去する為です。目的によっては省略してもよいでしょう。また、フェノクロの後はフェノールを完全に除去するためにクロイソ処理が必須です。

(6)この場合のエタ沈はプラスミドDNAを単離することです。が、sol.3を回収すればタンパク質の分析も・・・できるかも。実際にQIAGENなどからは1本の培養系からDNA、RNA、タンパク質を同時に精製するkitがあります(ありました。今はちょっとわかりません)

(2)と(3)はゲノムDNAのtopologyの問題ですかね。
僕は専門ではありませんので、曖昧です。すみません。

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、そ...続きを読む

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Q電気泳動の原理について

今大学で電気泳動を盛んにしているのですが、いまさらながら電気泳動の原理や、なぜしているのかなどがいまいちよくわかりません・・・バンドがでてきますが、何を表しているのかもいまいちです。。情けない限りなのですが、どなたか教えていただけるとありがたいです。染色体地図をかいてくるとういう課題もでているのですが、電気泳動の意味がよくわかっていない自分には手のつけようのない課題なのです。どうかお願いします。

Aベストアンサー

DNAの電気泳動の目的は簡単に言うと、さまざまな大きさの断片をその大きさによって分離することです。
すなわち、泳動後に現れるバンドは、大きさのまとまった断片の集まりということになります。

まず、DNAは核酸という酸であるということはご存知のことと思います。
酸は水溶液中でマイナスに帯電します。
つまり、電気を流すとプラスの方へ流れていくことになります。
DNAを流すゲルは肉眼では見えないほど細かい網目構造となっているので、より小さな断片ほどその網目構造を素早く縫って移動できます。
これは、よりプラス極の近くに現れるバンドほど小さな断片であることを意味します。

以上のことをまとめるとどうでしょう?電気泳動の全体像が見えてきませんか?

Q遺伝子

形質転換効率ってどのように計算すればいいんですか?とても困っています・・・助けてください

Aベストアンサー

形質転換効率は、ベクター1 micro gあたりのコロニー数(colony forming unit, cfu)であらわします。
10 ngのプラスミドベクターを使って形質転換をして、1 mLの培地を加えて回復培養をし、そのうち10 microLをまいたら、250 コロニー生えたとしましょう。
まいた10 microLには10 ng x 10 microL/1000 microLで、0.1 ng 等量のプラスミドが含まれていることになります。
0.1 ngで250 コロニー生えたのですから、1 micro gに換算すると、250 cfu ÷0.1 ng = 250 cfu ÷( 0.1 x 10のマイナス3乗) micro g = 2.5 x 10の6乗cfu/ugとなります。これが形質転換効率を表します。
形質転換効率は、同じベクター、同じホストを使っても、ベクター量を少なくしたほうが高くなります。これは、ベクター量の増加と、形質転換数の増加が比例しないためです。


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