あるプラスミドベクターを、制限酵素で切断しました。
それを大腸菌コンピに形質転換し、LB+アンピシリン培地上に塗布したところ、コロニーが形成されました。

知人曰く、『環状でないプラスミドを取り込んだ大腸菌は生育しない』だそうですが、理由がいまひとつ解かりません。

切断部位がアンピシリン耐性遺伝子でないし、複製起点も潰れていないので、コロニーが生えてても特に疑問もないのですが…。

知識不足で恥ずかしい限りですが、御回答頂けたら幸いです。宜しくお願いします。

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A 回答 (1件)

複製起点が残っていたとしても直鎖状DNAが完全に複製されるかどうかは


わかりません。(されないような気がしますが…)

ですが、その直鎖状DNAを取り込んだ大腸菌に限っていえば、アンピシリン
耐性遺伝子からβラクタマーゼが産生されて、周囲に分泌されますので、
その大腸菌の周囲のアンピシリンが無効化された可能性は考えられます。
(サテライトコロニーと同じような感じで)
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Q大腸菌の抗生物質の作用の違いについて

はじめまして。大学で微生物の研究をしています。
わからないことがあったので宜しければ教えてください。
大腸菌の抗生物質であるアンピシリンと、ストレプトマイシンを加えた場合では大腸菌にあらわれる変化になにか違いはあるのでしょうか?
教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

耐性のない大腸菌に対しての反応の違い、ということでよろしいでしょうか。

#2の方の補足ですが、アンピシリン(βラクタム系抗生物質)は細胞壁合成酵素阻害剤ですので、静菌的に作用します。薬剤そのものによって溶菌はしないと思いますが、細胞壁を新たに合成することができないので、増殖(や成長)はできません。菌数は増えないので、結果的に自身の代謝によるストレス物質で徐々に死滅していきます。

一方のストレプトマイシン(アミノグリコシド系抗生物質)は30Sリボソームサブユニットに不可逆的に結合し、タンパク質合成を阻害しますので、細胞の生命活動が停止し、細胞が死滅します。こちらは殺菌的に作用します。

耐性という話もでたので蛇足します。
βラクタム系抗生物質に対する耐性は、多くのグラム陰性桿菌の場合、βラクタムを特異的に加水分解するβラクタマーゼという酵素によります。したがって培地中にβラクタマーゼを産生する細胞がいた場合、その系のβラクタム剤が徐々に減っていきます。前述の通り静菌的に作用しますので、耐性を持たずβラクタムにさらされつつも耐えていた(増殖できなかった)細胞も、ある程度βラクタムがなくなったところで増え始めます。
遺伝子操作などでβラクタム系の薬剤マーカーを使った場合、プラスミドの入った目的とする大腸菌の周りに、時間が経つとプラスミドの入っていない(耐性を持たない)はずれのコロニーが増え始めます(サテライト)が、これは上記の理由からです。

一方のストレプトマイシンは殺菌的に作用しますので、サテライトは比較的できません。アミノグリコシド耐性は、アミノグリコシド修飾酵素による薬剤の不活性化、または標的部位であるリボソームサブユニットの点突然変異がよく知られています。

耐性のない大腸菌に対しての反応の違い、ということでよろしいでしょうか。

#2の方の補足ですが、アンピシリン(βラクタム系抗生物質)は細胞壁合成酵素阻害剤ですので、静菌的に作用します。薬剤そのものによって溶菌はしないと思いますが、細胞壁を新たに合成することができないので、増殖(や成長)はできません。菌数は増えないので、結果的に自身の代謝によるストレス物質で徐々に死滅していきます。

一方のストレプトマイシン(アミノグリコシド系抗生物質)は30Sリボソームサブユニットに不可逆的に...続きを読む

Q大腸菌の形質転換とアンピシリン

大腸菌の形質転換実験を行いました。
大腸菌のコンピテンとセルにプラスミドを導入させ、それをアンピシリン含有LB寒天培地で培養しました。
培養後、形成されたコロニーを採取し、次は、坂口フラスコ内でアンピシリンを加えた液体培地で培養しました。
ここで、培地にアンピシリンを添加する理由を教えていただきたいのです。
LB寒天培地にアンピシリンを添加するのは、プラスミドを導入した大腸菌のみを培養するためだと思います。
では、坂口フラスコでの培養でアンピシリンを添加するのはなぜでしょう?自分なりにいろいろ調べたところ、「プラスミドを抜け落ちないようにするため」ということを知りましたが、これはどういうことなのでしょうか?
なぜ抜け落ちるのか、なぜアンピシリンを添加すると抜け落ちないのか、ということがよくわかりません。
ご存知の方は教えて下さい。よろしくお願いします。

Aベストアンサー

プラスミドには目的遺伝子+抗生剤耐性遺伝子(この場合アンピシリン耐性遺伝子)があるはずです。

1.コロニーを採取するまではアンピシリンが必要なのはわかりますね。プラスミドを持っているE.coliだけが生えるようにしているのです。

2.次に大量培養(まあ大量でなくてもいいのですが)、LB brothで培養するときには何がおきるでしょうか。

E.coliの分裂増殖です。アンピシリンがあると、プラスミドをもっているE.coliのみが増えますよね。アンピシリンでプレッシャーをかけていないとプラスミドがないE.coliがたまたま出来ると大量に増殖するのです。プラスミドの入ったE.coliが負けてしまうのですね。一般に抗生剤が入っていない培地で買い続けるとプラスミドは失ってしまいます。マニュアルや「バイオ実験イラストレイテッド」にも載っていたと思います。

ご参考になりましたら幸いです。

QPCRと大腸菌クローニングの違いについて教えてください

大腸菌によるクローニングを用いた解析の流れとして,PCR-Cloning-Sequencing法があるかと思います.

シークエンスにかける前に,わざわざ大腸菌でクローニングする理由が分かりません.シークエンスにかけるため,対象DNAを増やすのであれば,そのままPCRで増やしてはダメなのでしょうか?

クローニングには対象DNAを増やす以外の何か重要な意味があるのでしょうか?(PCRにカイネティクスがある事は存じております).専門書で確認したところ,ターゲットDNAを増幅させるという意味において,広義にはPCRもクローニングの一部だと書いてありました.

すいません.素人質問で申し訳ありません.
よろしくお願い致します.

Aベストアンサー

最近のPCR用の酵素はHigh Fidelity、正確性が高くエラーは入り難いですが、PCRで酵素反応を経ただけ、エラーの確率があがります。一方、大腸菌内で増やしたものはほとんどの場合増幅によるエラーは起こりません。(条件付でいろいろな例外もありますけど)

PCR産物は得られたDNA断片の数だけ酵素反応が起こった結果の産物です。その中にはエラーの入ったものと入っていないものが混ざっています。それを鋳型にして確かに幾らでも増やせますが、状況によってはエラーが入ったものが主要成分になります。

一方、プラスミドに繋いで大腸菌に入れると、一つの細胞あたり、一個のプラスミドが増幅されます。(これも条件付ですが、最終的にそうなります)そしてシングルコロニーを拾うことをクローニングと言います。(クローニングの本来の意味と現在の適用される範囲を調べてください)

その大腸菌は欲しい配列を含んだプラスミドを維持し、増やすことが出来ます。大腸菌はグリセロールストックで半永久的に保存できます。これはプラスミドすなわち欲しい遺伝子を維持することであり、現物を大腸菌の培養のみで増幅できる状態にあります。ここには配列の情報も必要ありません。現在のように情報がどこからでも手に入る場合はこの意味が弱くなったかもしれませんが、これは今後何をするにも大変有利な状況です。

実際にPCR、ダイレクトシークエンス、ということはよくやられています。しかし、シークエンスだけがすべてではありません。

簡単に言うと便利だから、かな。

最近のPCR用の酵素はHigh Fidelity、正確性が高くエラーは入り難いですが、PCRで酵素反応を経ただけ、エラーの確率があがります。一方、大腸菌内で増やしたものはほとんどの場合増幅によるエラーは起こりません。(条件付でいろいろな例外もありますけど)

PCR産物は得られたDNA断片の数だけ酵素反応が起こった結果の産物です。その中にはエラーの入ったものと入っていないものが混ざっています。それを鋳型にして確かに幾らでも増やせますが、状況によってはエラーが入ったものが主要成分になります。

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Q形質転換後の大腸菌コロニー

形質転換後の大腸菌コロニーを大量培養したいのですが、振盪培養装置の量的制限もあり、必要なタンパク量まで培養バッチを重ねることにしました。種菌である大腸菌コロニーは培養のたびに形質転換をしなければならないのでしょうか。形質転換してから日数をおいての使用や継代は可能でしょうか。よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

最も基本的なプロトコルは、精製した発現ベクターを適切な濃度で-30℃で保存しておき、
必要に応じて、大腸菌(大量に培養されるということなのでたぶんBL21(DE3)株とかかな
と推定します)を形質転換する、と書かれているとは思います。

ただ、実際にやった経験からいうと、
発現ベクターで形質転換した大腸菌BL21(DE3)をLB(amp)液体培地で培養し、OD660nmが
0.5から0.6くらいになったもの3に対して、80%グリセロール溶液1を混ぜたもの
(最終グリセロール濃度が25%程度)を1mLずつエッペンドルフチューブに分注して
-70℃ディープフリーザーで保存しておき、必要時には、それを直接LB培地に
入れて培養する、という方法で基本的には問題なかったです。

プラスミドが抜け落ちると、よく言われますが実際にそういう現象にあたったことは
1回しかありませんでした。

寒天培地で保存は4℃の冷蔵庫で倒置して保存ということになりますが、これは
賞味期限?が短いです。1週間くらいが限度と思ってください。時間がたてばたつぼど
増殖が明らかに悪くなります。継代するなら3日とかくらいの頻度で移し替えて
いかないとだめかな、という印象です。あと、寒天培地をつくったときにまだ温度が
高い状態でシャーレに培地を入れて固めたときには、冷蔵庫で冷やしたときに
水滴がでてびしょびしょになることがあるので、注意してください。

いずれにせよ、

(1)精製したプラスミドは-30℃で保存する
(2)プラスミドを増やす用に形質転換した大腸菌株のストック(たとえばDH5αにプラスミドが
 入っているもの)も上と同じように、グリセロールストックで-70℃保存しておく。
(3)形質転換した発現用大腸菌もグリセロールストックで-70℃保存しておく。

とかしておくと、実験が早く進むと思います。

最も基本的なプロトコルは、精製した発現ベクターを適切な濃度で-30℃で保存しておき、
必要に応じて、大腸菌(大量に培養されるということなのでたぶんBL21(DE3)株とかかな
と推定します)を形質転換する、と書かれているとは思います。

ただ、実際にやった経験からいうと、
発現ベクターで形質転換した大腸菌BL21(DE3)をLB(amp)液体培地で培養し、OD660nmが
0.5から0.6くらいになったもの3に対して、80%グリセロール溶液1を混ぜたもの
(最終グリセロール濃度が25%程度)を1mLずつエッペンドルフチューブに分注して
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Q大腸菌operon(オペロン)について

あるウィルスのDNAに大腸菌オペロンのDNAが400bpぐらいマッチングしました。こういう場合、このウィルスは大腸菌と関係していると考えられますか。GC%が大腸菌と一致していたら大腸菌をもとにしたものと考えてもいいでしょうか。

Aベストアンサー

大腸菌の配列とウイルスの配列を比べて見ましたが、
少なくとも、現時点でNCBIからダウンロードしたデータでは
そのように100%一致する領域は見当たりませんでした。
(SARSの配列にヒットしたのは、類縁のウイルスのみでした。)

ただし、大腸菌のご指摘の領域には、ISという、移動性因子が
含まれていることが分かりました。
そこで、この領域に一致する配列をデータベースで検索
したところ、大腸菌以外に、ヒトやイネなどの配列と
されているもののいくつかにもヒットしました。
これは、おそらく、ヒトやイネなどの塩基配列を決定する操作において、
一旦大腸菌でそのDNAを増やす過程において、ISが大腸菌の
ゲノムから飛び出して、ヒトやイネのDNAを載せたプラスミドに
飛び込んでしまったためであると思われます。

したがって、これらの現象は、あくまで、配列決定操作上の
誤りであり、ヒトやイネがそのような配列のDNAを持っているという
ことではないでしょう。

>それで仮説ですが、大腸菌にバイオ操作でウィルスを感染させて利用するような技術はありますか?そうすれば大腸菌のDNAや部分的な機能が含まれたりするのではないでしょうか。

つまり、上記の様に、大腸菌にウイルスを感染させたという
わけではなく、ウイルスのゲノムDNA配列を決定するにあたり、
その一部分ごとにしたウイルスゲノムDNAを大腸菌内で
増幅させた際に生じた混入と見るのが妥当でしょう。
(もし、どこかの時点で取得して来たウイルスの配列に
大腸菌の配列が含まれていたとした場合)

ちなみに、動物に感染するウイルスを大腸菌に感染させることはできません。
大腸菌に感染するウイルスの仲間もいますが、それは、
バクテリオファージと言われるものであり、ヒトなどの
動物に感染するものとは全く違うものです。
鳥にしか感染しないはずのウイルスがヒトに感染するように
なってしまうという様なレベルの違いではないのです。

大腸菌の配列とウイルスの配列を比べて見ましたが、
少なくとも、現時点でNCBIからダウンロードしたデータでは
そのように100%一致する領域は見当たりませんでした。
(SARSの配列にヒットしたのは、類縁のウイルスのみでした。)

ただし、大腸菌のご指摘の領域には、ISという、移動性因子が
含まれていることが分かりました。
そこで、この領域に一致する配列をデータベースで検索
したところ、大腸菌以外に、ヒトやイネなどの配列と
されているもののいくつかにもヒットしました。
これは、おそら...続きを読む

Qサテライトコロニー内の菌の形質について

おはこんばんちわ。
高校の授業で遺伝子工学の実習をやっているのですが、
どうしても気になることがあったので、質問させていただきます。

大腸菌にpUC19を導入し、アンピシリンとX-gal・IPTGによる大腸菌形質転換の実験を行いました。

その後、アンピシリンを含んだ培地で数日間培養したところ、青色のコロニーの周囲に白のサテライトコロニーが確認できました。

コロニーの色が変化しなかったことから、サテライトコロニー内の大腸菌ではLacZが働いていないという結果になりました。

この時、サテライトコロニーの大腸菌は完全にpUC19を含まないものだと証明できるのでしょうか?
仮説の証明としてレポーター遺伝子をpUC19に導入するという実験方法を考えましたが、予想される結果には遺伝子が正しく導入されていない可能性も含んでしまうと言うことで、完全には証明できない、とのことでした。

サテライトコロニーが起こる理由と考えられる全ての例を挙げようとすると、無数の実験をしなければいけないということになると思うのですが…
これは証明できる方法があるのでしょうか、もしくは完全には証明できないのでしょうか。どなたかご存知でしたら教えてください。よろしくお願いします。

おはこんばんちわ。
高校の授業で遺伝子工学の実習をやっているのですが、
どうしても気になることがあったので、質問させていただきます。

大腸菌にpUC19を導入し、アンピシリンとX-gal・IPTGによる大腸菌形質転換の実験を行いました。

その後、アンピシリンを含んだ培地で数日間培養したところ、青色のコロニーの周囲に白のサテライトコロニーが確認できました。

コロニーの色が変化しなかったことから、サテライトコロニー内の大腸菌ではLacZが働いていないという結果になりました。

この時、サ...続きを読む

Aベストアンサー

たぶんサテライトコロニーにpUC19は入っていません。
経験的に答えを知っているのですが、証明法をお望みのようなので、決定的な言葉は控えます。

pUC19によるアンピシリン耐性はβラクタマーゼによるものです。
βラクタマーゼとは、抗生物質であるアンピシリンを分解する酵素です。
pUC19が入っている大腸菌は、培地中のアンピシリンを分解します。
つまり、pUC19が入っているコロニーの周囲のアンピシリンは・・・

ではなぜ、pUC19の入っていない大腸菌は即座に殺菌されなかったのか。
アンピシリンなどのβラクタム系抗生物質は、細胞壁合成を阻害し、分裂を抑制します。これを静菌作用といいます。
したがって、耐性を持たない大腸菌の生命活動を即座に止める(殺菌する)ものではありません。
つまり、周囲のアンピシリンさえなくなれば、耐性を持たない大腸菌も・・・。

なお、レポーター遺伝子の考えもとても良いと思いますが、結果的にpUC19に含まれるX-galによって誘導されるガラクトシダーゼと同じことになると思います。
証明法としては、たとえば選択に用いる薬剤とプラスミドのマーカー遺伝子を、殺菌作用のある他の抗生物質に変えてみるとか、青いコロニーとサテライトコロニーから同じ操作でプラスミド抽出を試みて、どちらにプラスミドが入っているか確かめるか、などいかがでしょうか。

たぶんサテライトコロニーにpUC19は入っていません。
経験的に答えを知っているのですが、証明法をお望みのようなので、決定的な言葉は控えます。

pUC19によるアンピシリン耐性はβラクタマーゼによるものです。
βラクタマーゼとは、抗生物質であるアンピシリンを分解する酵素です。
pUC19が入っている大腸菌は、培地中のアンピシリンを分解します。
つまり、pUC19が入っているコロニーの周囲のアンピシリンは・・・

ではなぜ、pUC19の入っていない大腸菌は即座に殺菌されなかったのか。
アンピシリンな...続きを読む

Q大腸菌について。

とても初歩的なことをお尋ねさせていただきます。

・大腸菌は、もともと人間の大腸内で増殖・生存している菌なのに、それを食べてどうして病気になるのでしょうか?

・大腸菌の中で、ガスを発生するのが病原菌と聞いたことがあるのですが、ガスとは何なのでしょうか?

・一般的な菌検査では、大腸菌群(大腸菌とは関係ない??)、ガスを発生する菌か否かで検査するのでしょうか?具体的な菌名で検査しないのは、コストがかかるからでしょうか?

・食品で病原性大腸菌が発生する要因としてどんなことがあるのでしょうか?

以上ご回答のほどよろしくお願い申し上げます。

Aベストアンサー

ご職業は何でしょうか。質問者様の立場がわかるとより状況に即した回答ができると思います。
私は医師です。
・人間側の防御機構との釣り合いの問題です。細菌が優勢になると病気になります。O-157など人間にとって強烈な毒素を産生する一部の大腸菌は人間の大腸内にいません。
・その場合のガスとはCO2やH2がメインです。ガスを出さない病原性大腸菌も多くいます。
・ガスを産生する菌は大腸菌以外にもいます。ガス産生能は、菌を推定する一つの目安になります。具体的な菌名まで特定しないのは、まあ、コストというか、需要の問題です。抗菌薬治療するならもっと細かく分類が必要です。大腸菌群とは大腸の中にいる菌という意味で、大腸菌やその他の腸内細菌を含みます。
・細菌を含む生物は基本的に自然発生しません。外からの混入、増殖を減らす努力をしてください。

Q大腸菌の形質転換を利用したクローニング

先日実験で、大腸菌の形質転換を利用したクローニングを行いました。

集菌と科学的処理
(1)大腸菌の培養液を氷上で冷却した。
(2)培養液5 mLを遠沈管に移し、3000 rpmで5分間遠心した。
(3)大腸菌のペレットを崩さないように上側にして、培養液の上澄みをデカントして捨てた。
(4)あらかじめ冷やしておいた形質転換用溶液(TSS)500 nLにDMSOを25 nL入れて、混ぜた。
(5)(4)を500 nL加えた。
(6)ボルテックスで穏やかに撹拌して、ペレットを縣濁した。
(7)懸濁液を100 nLずつエッペン管に分注して、形質転換に用いた。
(8)ライゲーション反応のDNA溶液を5 nL加えて、指先で軽く撹拌した。
(9)氷上に14:05~14:25頃まで放置して、DNAを取り込ませた。

寒天培地への植え継ぎ
(1)DNAを取り込ませた大腸菌に500 nLのLB培地を加えた。
(2)37℃で15~60分インキュベートして、抗生物質耐性遺伝子が活性化するのを待った。
(3)別の遠沈管に大腸菌を50 nL移し、BL培地を250 nL加えかさあげした。
(4)それぞれの遠沈管に40 nLの100 mM IPTGと40 nLの40/mL X-galを加え、軽く撹拌した。
(5)100 ng/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地2枚に、それぞれの遠沈管の大腸菌を撒いた。
(6)滅菌したスプレッダーで水気がなくなるまで満遍なく広げた。
(7)37℃の気相インキュベーターに入れて、一晩放置した。

このような手順で実験を行ったのですが、全くコロニーが出来ませんでした。
なぜでしょうか?
よろしくお願いしますm(__)m

先日実験で、大腸菌の形質転換を利用したクローニングを行いました。

集菌と科学的処理
(1)大腸菌の培養液を氷上で冷却した。
(2)培養液5 mLを遠沈管に移し、3000 rpmで5分間遠心した。
(3)大腸菌のペレットを崩さないように上側にして、培養液の上澄みをデカントして捨てた。
(4)あらかじめ冷やしておいた形質転換用溶液(TSS)500 nLにDMSOを25 nL入れて、混ぜた。
(5)(4)を500 nL加えた。
(6)ボルテックスで穏やかに撹拌して、ペレットを縣濁した。
(7)懸濁液を100 nLずつエッペン管に分注して、形質...続きを読む

Aベストアンサー

この実験はプラスミドを使用したクローニングでしょうか?私が読んで気になった事を箇条書きします、

(1)大腸菌の量は吸光度計で測定しましたか?多すぎても、低すぎてもダメです。
(2)大腸菌の培養液は10分以上と十分に冷却しましたか?
(3)ボルテックスではなく、ピペッチングでペレットを優しく撹拌して下さい。
(4)氷上でDNAを取り込ませて20分した後、42度のインキュベーターやウォーターバスで30~45秒間ぐらいの熱ショックを与え、すぐ氷上に戻して急冷してから、37度でインキュベートしましたか?
(5)X-Galの溶液は遺伝子組み換え大腸菌の培養液に加えるのではなく、同量をLB寒天培地に広げるだけで良いです。これでも十分に青色が発色します。(37度でインキュベートしている間に、行えば良いです)
(6)遺伝子組み換え大腸菌は水気がなくなるまで満遍なく広げると言うよりも、コンタミを防ぐため100μlをパッパと広げる方が良いです。

このように改善すれば、上手く行くはずです。念のため、ポジティブコントロールも同時に行う事を勧めます、(A)トランスフォーメーションだけしなかった同じ大腸菌を、抗生物質のない寒天培地にまく。
(B)切断やライゲーションを行ってないDNA断片(抗生物質耐性遺伝子やガラクトシダーゼ遺伝子のみ入っているもの)をトランスフォーメーションした大腸菌を、抗生物質の入っている寒天培地にまく。
(A)でコロニーが出来てなければ大腸菌に問題がある、(B)でコロニーが出来なければ取り込ませるDNAに問題がある、という事が分かります。
また補足質問があれば、回答します。

この実験はプラスミドを使用したクローニングでしょうか?私が読んで気になった事を箇条書きします、

(1)大腸菌の量は吸光度計で測定しましたか?多すぎても、低すぎてもダメです。
(2)大腸菌の培養液は10分以上と十分に冷却しましたか?
(3)ボルテックスではなく、ピペッチングでペレットを優しく撹拌して下さい。
(4)氷上でDNAを取り込ませて20分した後、42度のインキュベーターやウォーターバスで30~45秒間ぐらいの熱ショックを与え、すぐ氷上に戻して急冷してから、37度で...続きを読む

Q大腸菌の遺伝子操作について・・・

大腸菌にプラスミドを加え形質転換させました。
最終的にLB/ampプレートに溶液をまき一日待ちました。

amp→アンピシリン(抗生物質)

大腸菌は紫外線に当てて発見できましたがこの大腸菌は最初の大腸菌と同じのができあがったと考えていいもですか?それとも違う物質なのですか?

Aベストアンサー

大腸菌をプラスミドを用いて形質転換したとき、LB/amp培地を使用したということは、そのプラスミドにはamp耐性の遺伝子が組み込まれているためです。プラスミドがうまく導入された大腸菌は(つまり、形質転換成功)amp耐性がつきますので、LB/amp培地上でも生育でき、コロニーが現れますが、プラスミドが導入されなかった大腸菌はamp耐性を持っていないため、LB/amp培地では生育できずコロニーとしては現れません。

一般的にプラスミドには抗生物質耐性の遺伝子がコードされているので、これを利用して形質転換したものとしてないものを選抜しています。最初の方のように大腸菌がもともとamp耐性を持っているとすれば、話は変わってきますが・・・。

質問の内容を見るとおそらく研究している方ではなく、大学の授業の課題のように思えます。だとすると、紫外線を当てたのは形質転換体とそうでないものを選抜する目的ではなく、形質転換後の大腸菌がどのように変わったのか(この場合、紫外線に反応する大腸菌を作出したのでは?かなり有名な遺伝子です)を見るためだと思います。

分子生物学を専攻に研究されている方にとっては、この問題はかなり基本の部分になりますが、実際に自分で体験しないと本で読むだけでは理解するのに時間がかかるのかもしれないです。今後分子生物学の分野の授業をとるとか、そちらのほうに興味があるのでしたら、本格的なものでなくても載っていると思うので、生化学の教科書等でプラスミドや形質転換について勉強されると良いですよ。

大腸菌をプラスミドを用いて形質転換したとき、LB/amp培地を使用したということは、そのプラスミドにはamp耐性の遺伝子が組み込まれているためです。プラスミドがうまく導入された大腸菌は(つまり、形質転換成功)amp耐性がつきますので、LB/amp培地上でも生育でき、コロニーが現れますが、プラスミドが導入されなかった大腸菌はamp耐性を持っていないため、LB/amp培地では生育できずコロニーとしては現れません。

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Q発現用大腸菌を使ったプラスミド抽出について

BL21(DE3)株を使ったプラスミド抽出は可能でしょうか?
プラスミド抽出には、日本ジェネティクス社のFastGene Plasmid Mini Kitを使用します。

よろしくお願いします。

Aベストアンサー

プラスミドは取れると思います。ただ BL21(DE3) は RecA が潰れてないので組換えが起こりますから、導入したプラスミドとは違ったものが混ざってくるかもしれません。精製したプラスミドで何をするのかわかりませんが、サブクローニング用の大腸菌でクローニングしなおした方が良いんじゃないでしょうか。


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