あるプラスミドベクターを、制限酵素で切断しました。
それを大腸菌コンピに形質転換し、LB+アンピシリン培地上に塗布したところ、コロニーが形成されました。

知人曰く、『環状でないプラスミドを取り込んだ大腸菌は生育しない』だそうですが、理由がいまひとつ解かりません。

切断部位がアンピシリン耐性遺伝子でないし、複製起点も潰れていないので、コロニーが生えてても特に疑問もないのですが…。

知識不足で恥ずかしい限りですが、御回答頂けたら幸いです。宜しくお願いします。

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A 回答 (1件)

複製起点が残っていたとしても直鎖状DNAが完全に複製されるかどうかは


わかりません。(されないような気がしますが…)

ですが、その直鎖状DNAを取り込んだ大腸菌に限っていえば、アンピシリン
耐性遺伝子からβラクタマーゼが産生されて、周囲に分泌されますので、
その大腸菌の周囲のアンピシリンが無効化された可能性は考えられます。
(サテライトコロニーと同じような感じで)
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QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Q大腸菌の形質転換とアンピシリン

大腸菌の形質転換実験を行いました。
大腸菌のコンピテンとセルにプラスミドを導入させ、それをアンピシリン含有LB寒天培地で培養しました。
培養後、形成されたコロニーを採取し、次は、坂口フラスコ内でアンピシリンを加えた液体培地で培養しました。
ここで、培地にアンピシリンを添加する理由を教えていただきたいのです。
LB寒天培地にアンピシリンを添加するのは、プラスミドを導入した大腸菌のみを培養するためだと思います。
では、坂口フラスコでの培養でアンピシリンを添加するのはなぜでしょう?自分なりにいろいろ調べたところ、「プラスミドを抜け落ちないようにするため」ということを知りましたが、これはどういうことなのでしょうか?
なぜ抜け落ちるのか、なぜアンピシリンを添加すると抜け落ちないのか、ということがよくわかりません。
ご存知の方は教えて下さい。よろしくお願いします。

Aベストアンサー

プラスミドには目的遺伝子+抗生剤耐性遺伝子(この場合アンピシリン耐性遺伝子)があるはずです。

1.コロニーを採取するまではアンピシリンが必要なのはわかりますね。プラスミドを持っているE.coliだけが生えるようにしているのです。

2.次に大量培養(まあ大量でなくてもいいのですが)、LB brothで培養するときには何がおきるでしょうか。

E.coliの分裂増殖です。アンピシリンがあると、プラスミドをもっているE.coliのみが増えますよね。アンピシリンでプレッシャーをかけていないとプラスミドがないE.coliがたまたま出来ると大量に増殖するのです。プラスミドの入ったE.coliが負けてしまうのですね。一般に抗生剤が入っていない培地で買い続けるとプラスミドは失ってしまいます。マニュアルや「バイオ実験イラストレイテッド」にも載っていたと思います。

ご参考になりましたら幸いです。

Qプラスミドの形態について

大学の授業で、プラスミドにはスーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイルがあると習いました。プラスミドの形態と性質について質問があります。
(1)菌内では、本来はスーパーコイルの状態ということでした。しかし、菌体内の図は、どれを見てもプラスミドは一重の円で表示されています。これにより、本来は開環状だと思っていました。よく本に載っているこのプラスミド図示の仕方は、ただ単純に書いたために円なのでしょうか?もう少し誤解を産まない程度のスーパーコイルの表示をしないのでしょうか?

(2)プラスミドは開環状は直鎖状よりコンパクトなので、早く泳動される、と書いてある本もあれば、直鎖状の方が早く泳動されると書いてある本もありどっちが早いのか分からなくなりました。前者の理由は、直鎖の方がゲルに絡まりやすく遅くなるということでした。後者は、開環状の方が、面積が大きいからゲルに引っかかりやすく直鎖より遅くなるということでした。どちらの理由も説得力がありますます分からなくなりました。プラスミドは、開環状と直鎖状はどちらが早く泳動されるのでしょうか?また、直鎖状と開環状で流れる速度が逆になる境となるDNAの長さがあるのでしょうか?

頭がこんがらがりました。どなたかよろしくお願いします。

大学の授業で、プラスミドにはスーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイルがあると習いました。プラスミドの形態と性質について質問があります。
(1)菌内では、本来はスーパーコイルの状態ということでした。しかし、菌体内の図は、どれを見てもプラスミドは一重の円で表示されています。これにより、本来は開環状だと思っていました。よく本に載っているこのプラスミド図示の仕方は、ただ単純に書いたために円なのでしょうか?もう少し誤解を産まない程度のスーパーコイルの表示をしないのでしょうか?

(2)...続きを読む

Aベストアンサー

>スーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイル
開環状コイル、直鎖状コイルという言葉はないと思いますが(直鎖状「コイル」なんて説明している人がいるとしたら、阿呆です)。

正確には、英語ではそれぞれcovalently closed circular (ccc、またはsuper coiled)、open circular(OC)、linearといいます。環状二重鎖DNA自体がよじれて、高次構造としてコイルを作っているからあえてスーパーコイルという表現がつかわれているので、そういう高次構造をつくらない開環状や直鎖状に「コイル」をつけて使うのはナンセンスです。

>これにより、本来は開環状だと思っていました。よく本に載っているこのプラスミド図示の仕方は、ただ単純に書いたために円なのでしょうか?もう少し誤解を産まない程度のスーパーコイルの表示をしないのでしょうか?

ちょっと勉強すれば、それが単純化したschemeだということは了解しているので実際上全く問題ないとおもいますが。それより、実用上、実際上はプラスミドの一次構造(乗っている遺伝子の構造や向き)を示すために作図するので、トポロジーを保ったままである開環状で示すのは理にかなっています。

>プラスミドは開環状は直鎖状よりコンパクトなので、早く泳動される、と書いてある本もあれば、直鎖状の方が早く泳動されると書いてある本もありどっちが早いのか分からなくなりました。前者の理由は、直鎖の方がゲルに絡まりやすく遅くなるということでした。後者は、開環状の方が、面積が大きいからゲルに引っかかりやすく直鎖より遅くなるということでした。

もし、そんなことを言い切っている本があるなら(特に前者)、それはろくなものではありません。もうちょっといい教科書を読みましょうよ。どちらかというと後者の記述が正しいです。面積というかファンデルワールス体積ですかね。ゲルのメッシュの中を直鎖状は蛇のようにDNA分子の長軸に方向に潜り抜ける(そのため長いほどくぐりぬけるのが遅くなる)のにたいして開環状だとどの方向からでもメッシュに入りにくいので。

一般的にはcccがずば抜けて移動度が小さいというのは良いとしても(これもEtBr濃度などで変わる)、OCとlinearは微妙でかなり近いことが多いです。泳動の条件(エチジウムブロマイドの有無やその濃度、ゲル濃度)などによって逆転することもあるとされています。スタンダードな条件ではOCはlinearよりやや遅く、私が経験してきた中ではこれが逆転したことはありません。

>スーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイル
開環状コイル、直鎖状コイルという言葉はないと思いますが(直鎖状「コイル」なんて説明している人がいるとしたら、阿呆です)。

正確には、英語ではそれぞれcovalently closed circular (ccc、またはsuper coiled)、open circular(OC)、linearといいます。環状二重鎖DNA自体がよじれて、高次構造としてコイルを作っているからあえてスーパーコイルという表現がつかわれているので、そういう高次構造をつくらない開環状や直鎖状に「コイル」をつけて使うのはナ...続きを読む

Q非環状プラスミドのライゲーションについて

よろしくお願いします。大腸菌での異種発現にとりくんでいる学生です。

大腸菌に目的遺伝子を形質転換する場合、
非環状プラスミドではタンパク質は作られないのでしょうか?

いま私がもってるのは目的遺伝子が導入された環状のプラスミドを
インバースPCRしたものです。
インバースPCRは目的遺伝子の一部を削る目的で行ったので、
アンピシリン耐性遺伝子や複製起点はそのまま残ってます。
非環状で、また両端はともに平滑末端です。
forward側はリン酸基がなく、reverse側はリン酸基があります。
PCR後の精製は済んでます。

教官から
"平滑末端の場合は大腸菌が環化のプロセスを行うから、
ライゲーションせずに形質転換していい"、
というよう助言をいただいたんですが、本当に大丈夫か心配です。
いろいろ探してみましたが、そういった記述のある文献はまだ見つけられません。

非環状のプラスミドで発現がうまくいった、またはそういう文献を読んだことのある方、
ぜひお話をお聞かせください。

Aベストアンサー

理論的にはうまくいくと思います。

ただ、プラスミドがプラスミドらしくあるためには環状(スーパーコイル)である必要があります。

環状であることでori点から「ホスト細胞の染色体と独立して増幅できる」という利点があるからです。

大腸菌を使うってことは、
30分に一回の分裂→猛烈に増える→一緒にプラスミドも増える→タンパクも増える
ということです。

おそらく、形質導入された大腸菌ではタンパク発現できると思います、ただ、リニアのままだとプラスミドが増えないので
タンパクの発現は見かけ上、皆無になると思います。

やるならば、コンピテントセルを100mlくらい使って、たくさんのリニアプラスミドをトランスフォームすれば可能かもしれません。
しかし、現実的ではありません。

さて、大幅に脱線しましたが、教官の仰っていることは嘘ではありません。
ですが、結合する活性はそれほど高くありません。

よって、セルフライゲーションくらいであればポツポツとコロニーが生えると思います。
(それが切れ残りでない保障はありませんが)

しかし、インサートがあるライゲーションであれば、ライゲース処理なければ難しいと思います。

こっそりライゲーションすることをお勧めしますが、バレて怒られるかもしれません。

理論的にはうまくいくと思います。

ただ、プラスミドがプラスミドらしくあるためには環状(スーパーコイル)である必要があります。

環状であることでori点から「ホスト細胞の染色体と独立して増幅できる」という利点があるからです。

大腸菌を使うってことは、
30分に一回の分裂→猛烈に増える→一緒にプラスミドも増える→タンパクも増える
ということです。

おそらく、形質導入された大腸菌ではタンパク発現できると思います、ただ、リニアのままだとプラスミドが増えないので
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Qアンピシリンの失活温度について

アンピシリンの失活温度について教えてください。

LB(Amp)のプレート培地を作製する時にいつも思うことです。

オートクレーブ後の三角フラスコに入っているLB培地に、いつアンピシリンを添加すればいいのかわかりません。

僕の場合は、三角フラスコをクリーンベンチ内で両手で触って円を描くように揺らしてみて、手をつけてられる熱さまで冷ましてから入れるようにしています。

宜しくお願いします。

Aベストアンサー

私も学部生の頃に同じことを考えましたが。。。結論は結構微妙なところだと思います。アンピシリンは酵素のように高温になると変成していっぺんに失活する訳ではなく、高温になるほど分解の進みが早くなるわけですよね。(もちろん1時間くらい煮沸すればかなり失活するかもしれませんが。。)。というわけで、結局実験的にできるだけ影響が起きない(しかし、ゲルが固まらない)ような妥協点の温度でやるために手で触れる=約60℃で添加することがスタンダードになってるわけです。

QアルカリSDS法におけるDNAとプラスミドの分離について

大学生になり、生物実験でアルカリSDSを行っている者です。
アルカリSDSによるゲノムDNAとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは1本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、とありました。そしてボルテックスはsolutionIIを加えた以降は禁止で転倒混和ですが、これは激しいボルテックスによりゲノムDNAも粉々になって上清画分に出てきてしまうため、また、膜にゲノムDNAは結合していて膜とともに沈殿させることができるが、DNAが細かく切れると膜とともに沈殿させることができないため、という文もありました。疑問に思うことは以下の6つです。

(1)一本鎖になるとニックが入りやすくなるのに、プラスミドは二本鎖に戻し、ゲノムDNAを一本鎖のままにすることが、ボルテックスなどでゲノムDNAが細かくなるのを防ぎたいということと矛盾している気がします。細かくなると不都合になるのになぜわざわざ一本鎖にするのでしょうか?
(2)その後のエタ沈でDNAを沈殿させますが、一本鎖のほうが二本鎖より沈殿させやすいのしょうか?原理的にはDNAはエタノールに不溶性なため沈殿することを考えると、一本鎖でも二本鎖でも不溶性なことには違いがありませんよね?一本鎖の方がもつれて絡まりやすいから凝集するのでしょうか?
(3)ゲノムDNAは菌体の膜に結合していて一緒に沈殿しやすいというイメージがよく分からないのですが、膜に所々DNAが細胞骨格などとともに結合しているのでしょうか?何かのタンパクを介しているのでしょうか?
(4)solitionIでTris-HCl(pH.8.0)などの緩衝液を加え、菌体をボルテックスして懸濁する必要があるのは後のsolutionII以降の操作のためにどのような目的がありのでしょうか?EDTAでDNaseなどを不活性化するのは分かるのですが…。またグルコースも加えるのは何のためなのでしょう。Tris-HClで十分緩衝液になっている気がします。
(5)エタ沈の前に、フェノールクロロホルム抽出をはさむプロトコールがありました。フェノールクロロホルム抽出をはさまなくても、solutionIIのアルカリ性でタンパクは変性し、不溶性となるので、核酸と分離できるはずですが、はさむ方法もあるのは、よりタンパクを取り除くためでしょうか?
(6)こちらは、確認質問なのですが、エタ沈の目的は核酸の沈殿であって、タンパクとの分離はできませんよね?

ちまちまとすみませんが、どなたかよろしくお願いします。

大学生になり、生物実験でアルカリSDSを行っている者です。
アルカリSDSによるゲノムDNAとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは1本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、...続きを読む

Aベストアンサー

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、それを防ぐ為に穏やかな条件で回収しているのではないでしょうか。

(2)これはエタノール沈殿の条件では、一本鎖、二本鎖に違いはあまりないと思います。

(3)細胞質中で膜結合性タンパク質との巨大複合体として存在していると言われています。sol3の後の遠心で一緒に巻き込まれて沈殿する、というようなイメージではないでしょうか。

(4)EDTA等は、仰るようにDNAの安定化の為だと思います。
グルコースは浸透圧のコントロールとして、また後のエタノール沈殿のときにはDNAの共沈剤の効果があると言われています。浸透圧のコントロールとして塩を加えてもよいのですが、塩はDNAと不溶性複合体をつくりますので、最近のプロトコルはglucoseみたいですね(私が学生の頃はEDTA以外特になにも入っていませんでした)。後者はエタ沈の時にグリコーゲンを加える事があるのと一緒ではないでしょうか。

(5)仰るようにタンパク質を完全に除去する為です。目的によっては省略してもよいでしょう。また、フェノクロの後はフェノールを完全に除去するためにクロイソ処理が必須です。

(6)この場合のエタ沈はプラスミドDNAを単離することです。が、sol.3を回収すればタンパク質の分析も・・・できるかも。実際にQIAGENなどからは1本の培養系からDNA、RNA、タンパク質を同時に精製するkitがあります(ありました。今はちょっとわかりません)

(2)と(3)はゲノムDNAのtopologyの問題ですかね。
僕は専門ではありませんので、曖昧です。すみません。

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、そ...続きを読む


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