HPLCとは,どのようなものでしょうか?
本をみたのですが,原理がいまいちよく分かりません,
ご存知の方がいましたら,おしえてください.

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A 回答 (5件)

お礼を拝見しました。


高圧のカラムを通過した液は色々な成分が分離された状態で順番に流れ出てきます。この液は検出器に流れ込むのですが、紫外線吸収を持つ物質では紫外線検出器、可視光線の吸収が特異的なものでは可視光線検出器、紫外線吸収がないものについては、他の偏光などの測定ができる検出器を用いるのです。
多くの物質は特異的な紫外線吸収を持ちます。溶液にして、全波長スキャンを行うと、ある波長において吸収のピークを持つ波形となります。その部分の波長を用いて測定することが多いのです。
丁度、連続した吸光光度分析を行っていると考えてください。
以上kawakawaでした
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この回答へのお礼

再度,お返事をありがとうございました.
調べようとしているサンプルがどのような吸収の特異性(紫外線や可視光線など)を持つのか分からないときには,全波長スキャンをして特異的な吸収波長を見つけだし,その波長を使ってサンプル量を測定するということなのですね.ありがとうございます.HPLCの原理をつかめてきました!
皆さんからお寄せ頂いた回答やアドバイス,URLを参考にさせていただいて,原理・実技共にもっと勉強しようと思います.HPLCの使用に関して,また質問させていただくことがあるかも知れません.その時はどうぞ,よろしくお願いします!

お礼日時:2001/03/21 16:11

かつてはカラムクロマトグラフィーという手法が一般的でした。

つまり、長いガラス管にシリカゲル等を充填し、そこに試料溶液を流し、ついで溶離液を流していました。シリカゲルなどへの吸着力と溶離液への溶解度のバランスによって、試料溶液中の物質が分離するのです。
この方法は数日間の放置といった長時間を要するものだったのですが、HPLCはステンレス管の中にオクタドデシル基を持つシリカゲルなどを充填し、一定の流量や流速を保つことができるポンプで溶離液を流し、短時間で高性能の分離をすることを可能にしたものです。
基本的な理論はTLCやカラムクロマトと同じですネ。
検出は一般的には紫外線吸収や可視光線の吸収で行いますが、蛍光や屈折などを利用することもできます。
以上kawakawaでした
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この回答へのお礼

皆様:
回答,アドバイス等をお寄せいただき,ありがとうございました(失礼ですが,この欄にまとめて,お礼とさせていただきました).HPLCの原理の概要をつかむことが出来ました.これまでに調べた本では,私にとっては専門的過ぎて原理がつかみ難かったので,簡潔な説明を頂けてありがたく思います.ところで,どのように「紫外線吸収や可視光線の吸収」を利用するのか,また「蛍光や屈折」はどのように用いるのか,検出方法についての説明をもう少しいただいてもよろしいでしょうか.よろしくお願いします. 

お礼日時:2001/03/19 01:20

ものの本によると「HPLC(高性能液体クロマトグラフィー)の分離原理は吸着、イオン交換、ゲルろ過、疎水相互作用、逆相クロマトグラフィーなどいろいろだが、分離能のよいカラムを使い、ずっと短時間ではるかによい分離を実現する。

」そうです。

要するに、ふつうのクロマト(上に挙げたようなやつ)の速くて分離能のいいやつです。HPLCは高圧(350気圧)で移動相を流す事によってスピードを上げたりしているわけです。

ふつうのクロマトの原理まで解説すると長くなりそうなので今はやめときます。知らなかったら応答して下さい。
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直接的な回答ではありませんが、以下のサイトに関連質問の回答がありますが、参考になりますでしょうか?


HPLC(液体クロマトゴラフィー)でも使用するカラムによって化合物の分離する原理はことなりますので、紹介した成書でご自分に合うものを見つけて勉強してください。

ご参考まで。

参考URL:http://www.okweb.ne.jp/kotaeru.php3?q=28512
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HPLCとは、高速(高圧)液体クロマトグラフィーの略です。


高圧条件下で、ガラス粉を吹きつけたものに、液体の試料を流すというような方法です。
ちょっと不十分ですが、こんな感じの方法です。
下記のURLにアクセスしてみてはどうでしょうか?

参考URL:http://www.sdk.co.jp/shodex/japanese/kouza.htm
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Q液クロ(HPLC)基礎を教えて下さい。

現在、仕事でHPLC(agilent社製)を使用していますが、まったく理論とかがわかりません。ある程度、仕事で使う部分や操作方法は教えてもらったのでルーチンワークに支障はでていないのですが、これから応用していくにあたり不安だらけです。
HPLCの基礎(カラムのC18とかシラノール基だとか)を学べるHPや本があったら教えてください。

Aベストアンサー

液クロ 虎の巻 などがお薦めです。
「液クロ 虎の巻」で検索して、本屋のサイトに行くと
お薦めの参考書が出てきます。

Q検量線の計算方法について

こんにちは。
現在HPLCを扱っております。検量線を使っているのですが
計算方法がよく理解できておりません。
【化粧品100g中に有効成分Aは何g含まれているか】を求めるものです。
まず、
標準品 0g、0.1g、0.3g、0.5g を精密に量り、全て精製水で正確に
100mlとします。この各液から、さらに1mlを精密に量りとり、精製水を
加えて正確に100mlとします。

試料は 1mlを精密に量り、精製水を加えて正確に100mlとしました。

ピークのAREAですが【標準品】
0.1g→ 574221
0.3g→ 1671182
0.5g→ 2717212
【試料AREA】は1738876 です。
Excelで検量線の計算式を出したところ下記のような式になりました。
y=5E+06x + 46962  R2 =0.9998

この場合、100g中に何g含まれているかを求めるには
どうしたらいいのでしょうか?
私なりに計算して四捨五入で0.3gとなったのですが
あっているでしょうか?

長くなってしまいましたが、教えてください!

こんにちは。
現在HPLCを扱っております。検量線を使っているのですが
計算方法がよく理解できておりません。
【化粧品100g中に有効成分Aは何g含まれているか】を求めるものです。
まず、
標準品 0g、0.1g、0.3g、0.5g を精密に量り、全て精製水で正確に
100mlとします。この各液から、さらに1mlを精密に量りとり、精製水を
加えて正確に100mlとします。

試料は 1mlを精密に量り、精製水を加えて正確に100mlとしました。

ピークのAREAですが【標準品】
0.1g→ 574221
0.3g→ 1671182
0.5g→ 27...続きを読む

Aベストアンサー

ちょっと整理するために長くなりますが、順番に書きますね。

1.まず検量線に用いた標準溶液の濃度をきちんと計算しましょう。
○標品 0g、0.1g、0.3g、0.5g
 →mgに換算すると0mg, 100mg, 300mg 500mg
○全て精製水で正確に100mlとする
 →濃度は0mg/ml, 1mg/ml, 3mg/ml, 5mg/ml
○1mlを量りとり精製水を加え100mlとする(100倍希釈)
 →濃度は0mg/ml, 0.01mg/ml, 0.03mg/ml, 0.05mg/ml
 →μgに換算すると0μg/ml, 10μg/ml, 30μg/ml, 50μg/ml

2.計算した濃度(μg/ml)を横軸xに、HPLCで得られた面積の値を縦軸yにしてグラフを描きます(エクセルならば散布図ですね)。
この時、0μg/mlの試料を分析したときの値も使いましょう(ピークが出ないのならば、面積は0とする)。

3.近似式を追加して検量線の式を計算させると、
   y = 54291x + 19103  R2 = 0.9997
となります。

4.これで検量線ができたので、未知試料を分析したときのピーク面積1738876をyの部分に代入して計算します。

5.xの値として31.6769...(μg/ml)と出てきます。

6.この値はあくまでも"分析した試料"の濃度です。目的としている化粧品1mlを100mlに希釈したものがこの濃度であることから、化粧品中の濃度は100倍して約3158(μg/ml)となります。mgやgに換算しなおすと、それぞれ3.2mg/ml、0.0032g/mlとなります。

7.もし【化粧品"100ml"中に有効成分Aは何g含まれているか】ということならば、単純に濃度に100mlをかけて、0.32gとなります。
ここで注意が必要なのは、【化粧品"100g"中に有効成分Aは何g含まれているか】となっていることです。厳密には100mlと100gは同じ量を表していません。化粧品100mlの密度(g/ml)が分かればこの値を0.32にかければ【化粧品"100g"中に有効成分Aの量】が出せます。密度が不明なときは、例えば100mlを正確に量り取ってから、その質量を精密天秤で測ってください。質量÷体積で密度が計算できます。

ちょっと整理するために長くなりますが、順番に書きますね。

1.まず検量線に用いた標準溶液の濃度をきちんと計算しましょう。
○標品 0g、0.1g、0.3g、0.5g
 →mgに換算すると0mg, 100mg, 300mg 500mg
○全て精製水で正確に100mlとする
 →濃度は0mg/ml, 1mg/ml, 3mg/ml, 5mg/ml
○1mlを量りとり精製水を加え100mlとする(100倍希釈)
 →濃度は0mg/ml, 0.01mg/ml, 0.03mg/ml, 0.05mg/ml
 →μgに換算すると0μg/ml, 10μg/ml, 30μg/ml, 50μg/ml

2.計算した濃度(μg/ml)を横軸xに、HPLCで得られた面...続きを読む

Q検量線

検量線とはどういったものなのか?
検量線を引くとはどういったことをすればいいのかおしえてください。

Aベストアンサー

masazo27さんの2番煎じとなりますが、改めて説明を試みたいと思います。
検量線を引くとは、測定器の固有差を見極め、その固有差を見極めた上で、未知試料について正確な測定を行うことを目的にしています。
例えば、ある水溶液中の砂糖の濃度を知ることが目的であるとします。砂糖の濃度を知ることが目的の検量線とは、砂糖0.1g、0.2g、0.3gをそれぞれ1Lの水に溶かし(あらかじめ濃度が既知の試料を作成し)、それを測定器にかけ、測定器の指示値を記録します。それを、横軸を濃度、縦軸を指示値にとったグラフ用紙に記入し、直線なり曲線で結びます(直線か、曲線かは理論的なものに依存します)。こうしてできたラインが検量線です。この検量線により、測定器の実際の指示値から濃度を推定できるようになります。ただし、検量線は濃度0.1~0.3g/Lの間で作成したので、その検量線の有効性もその間と言わざるを得ません。検量線から推定して1.5g/Lとでた場合には、その値の信憑性は低いと言わざるを得ないでしょう。その際は、O,1.0,2.0g/Lの既知試料等で検量線を引き直す必要があると思います。

masazo27さんの2番煎じとなりますが、改めて説明を試みたいと思います。
検量線を引くとは、測定器の固有差を見極め、その固有差を見極めた上で、未知試料について正確な測定を行うことを目的にしています。
例えば、ある水溶液中の砂糖の濃度を知ることが目的であるとします。砂糖の濃度を知ることが目的の検量線とは、砂糖0.1g、0.2g、0.3gをそれぞれ1Lの水に溶かし(あらかじめ濃度が既知の試料を作成し)、それを測定器にかけ、測定器の指示値を記録します。それを、横軸を濃度、縦軸を指示値にとったグラ...続きを読む

QHPLC初心者用の本を探しています。

HPLC(high peformance liquid chromatography)の全くの初心者です。卒業した学部も化学系ではありません。

そのような者でも、HPLCを一応使えるようになるために必要な知識がのっている、実践的な初心者用の本を探しています。
どうぞよろしくお願い致します。

Aベストアンサー

これかなー、↓
液体クロマトグラフィーQ&A100―例題で学ぶ基礎理論と技術
松下 至【著】 技報堂出版 (2000/06/25 出版)
235p / 21cm / A5判 ISBN: 9784765503877
NDC分類: 433.4 価格: ¥3,150 (税込)

少し古いが、こっちかも、↓
液体クロマトグラフィー100のテクニック―これだけ知れば使いこなせる
松下 至【著】技報堂出版 (1997/02/05 出版)
77p / 26cm / B5判 ISBN: 9784765503846
NDC分類: 433.4 価格: ¥2,940 (税込)

いや、以下のシリーズは分析化学会関連の本だが、表題が笑える(笑い死ぬ)
内容はまとも、

液クロ虎の巻―誰にも聞けなかったHPLC Q&A
中村 洋【監修】 液体クロマトグラフィー研究懇談会【編】
(つくば)筑波出版会 丸善〔発売〕 (2001/11/22 出版)
162p / 26cm / B5判 ISBN: 9784924753471 NDC分類: 433.4
価格: ¥2,940 (税込)

これから始まって、「龍の巻」「豹の巻」「犬の巻」「武の巻」「文の巻」まである。まずは虎の巻からどうぞ。
目次は紀伊国屋様のbookwebで読めます。↓
http://bookweb.kinokuniya.co.jp/

これかなー、↓
液体クロマトグラフィーQ&A100―例題で学ぶ基礎理論と技術
松下 至【著】 技報堂出版 (2000/06/25 出版)
235p / 21cm / A5判 ISBN: 9784765503877
NDC分類: 433.4 価格: ¥3,150 (税込)

少し古いが、こっちかも、↓
液体クロマトグラフィー100のテクニック―これだけ知れば使いこなせる
松下 至【著】技報堂出版 (1997/02/05 出版)
77p / 26cm / B5判 ISBN: 9784765503846
NDC分類: 433.4 価格: ¥2,940 (税込)

いや、以下のシリーズは分析化学会関連の本...続きを読む

Q薄層クロマトグラフの展開溶媒について

薄層クロマトグラフで使用する展開溶媒に使用する一般的な溶媒は何なのか?溶媒の組合せはどうするのか?
また、展開を早くしたい場合など比率をどのように変えればいいのか教えて下さい。

Aベストアンサー

対象物質がわからない限り、一般的、と言われても困るんですが。

単純脂質であれば、ヘキサン - ジエチルエーテル (- 酢酸)、

リン脂質であれば クロロフォルム - メタノール - 水 (あるいは、アンモニウム水)

糖脂質であれば、基本は クロロフォルム - メタノール - 水 ですが、塩を入れたり、で。

一般に展開を早くすると分離が悪くなり、Spot も広がります。適切な展開条件は、物質によって変わってきて、必ずしも早くする必要が理解できないんですが。

Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

QLC/MSとLC/MS/MSの違いとは?

LC/MSとLC/MS/MSの違いはナンでしょうか?
LC/MSの理論をきちんと調べればわかるのかもしれませんが、
よくわかるHPなどあったら教えてください

Aベストアンサー

ここらへんでしょうか、LC/MSとの違いも書いてあります

http://www.get-c.co.jp/lc-ms-ms.pdf

Qクロマトグラフィーの種類について

液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー

これらの用語の関係を教えて下さい。◯◯クロマトグラフィーは◯◯クロマトグラフィーの一種みたいな感じにお願いします。

Aベストアンサー

一定のテーマで分類してみると以下のようになります。

<移動相による分類>
○ガスクロマトグラフィー:移動相にガスを用いるもの
○液体クロマトグラフィー:移動相に液体を用いるもの
(○超臨界流体クロマトグラフィー)

<固定相の形状による分類>
○カラムクロマトグラフィー:固定相を筒状(カラム)のものに詰めて利用するもの。
○薄層クロマトグラフィー:固定相を板状にするもの

<分離原理による分類>
○分配クロマトグラフィー:分配係数の差を利用して分離する
○吸着クロマトグラフィー:吸着力の差を利用して分離する
○イオン交換クロマトグラフィー(イオンクロマトグラフィーとも):イオン交換における平衡定数の違いを利用して分離する
○ゲル(浸透または濾過)クロマトグラフィー:分子の大きさと多孔質に対する分散の差を利用して分離する
 ※原理名的には分子排斥クロマトグラフィー
○アフィニティークロマトグラフィー:生体高分子との親和性(アフィニティー)の差を利用して分離する

<装置名として>
○高速液体クロマトグラフィー
液クロ装置のうち、高圧液流に対応した装置のこと。機器分析装置としての液クロならば今はほとんどこれかと。
なお、カラムと検出器を自分で選択することで、上記のいろいろな分離原理を利用できる
○イオンクロマトグラフィー
液クロ装置の仲間。イオンクロマト分析用に特化した構成の液クロ装置。
こちらは基本的にはイオン交換クロマト専用。


用語の各原理/解説については、専門書や他のウェブサイトを参照された方がよいかと思います。
以上、参考まで。

参考URL:http://www.hitachi-hitec.com/science/lc_basic/lc_course1.html

一定のテーマで分類してみると以下のようになります。

<移動相による分類>
○ガスクロマトグラフィー:移動相にガスを用いるもの
○液体クロマトグラフィー:移動相に液体を用いるもの
(○超臨界流体クロマトグラフィー)

<固定相の形状による分類>
○カラムクロマトグラフィー:固定相を筒状(カラム)のものに詰めて利用するもの。
○薄層クロマトグラフィー:固定相を板状にするもの

<分離原理による分類>
○分配クロマトグラフィー:分配係数の差を利用して分離する
○吸着クロマトグラフィー:吸着力の差...続きを読む

Q科学の実験手順・操作のフローチャートの書き方がよく分かりません

お恥ずかしい話なのですが、
実験操作・手順のフローチャートの良い書き方が
未だによくわかりません。

僕が今回書き方がよくわからなかったのは、
化学的手法による抽出の操作でした。
酢酸エチル抽出がどうとかこうとか・・・
(図書館で少し調べてみたのですが、なかなか見つからなくて・・・)

なにかアドバイスがありましたらお願いします。
別に上記のようなものではなく、
どのような実験についてでも結構です。

皆さんの色々なフローチャートを参考に出来たら、と思っていますので。

お願いします。

Aベストアンサー

実験手順のフローチャートですから、実験を行った通りの順序、手法を書けば良いのです。
書き方はシンプル・イズ・ベスト!
誰もがそのチャートを見て、同じ操作が出来るように目指して書いて下さい。
実験手順、操作のフローチャートなんて、料理のレシピみたいなもんです。

「やった事」だけを書けば良いのですから、そう悩む必要はないと思いますよ。
むしろ、実験結果における考察の方が大切です。

古いモノですが、私が学生の時やった
「アルカリ性フォスファターゼによるp-ニトロフェニルリン酸の加水分解における温度の検討」
という実験のフローチャートを書きます。

反応液調製      酵素液調製
 |          |
 | pre-incubate 5min. |
 |←―――――――――|
 |  1ml添加
 ↓
mix
 ↓
incubate 20min.
 ↓
saturated NO2CO3 sol. 1ml添加
 ↓
mix
 ↓
A400測定
 ↓
検量線の式からp-NP生成量を求める
 ↓
酵素活性で表す
 ↓
グラフ用紙にプロット
 ↓
至適温度を求める

長くてすいません。下付き文字がないので、変な部分ありますが、こんな感じです。
参考になると良いのですが・・・・

実験手順のフローチャートですから、実験を行った通りの順序、手法を書けば良いのです。
書き方はシンプル・イズ・ベスト!
誰もがそのチャートを見て、同じ操作が出来るように目指して書いて下さい。
実験手順、操作のフローチャートなんて、料理のレシピみたいなもんです。

「やった事」だけを書けば良いのですから、そう悩む必要はないと思いますよ。
むしろ、実験結果における考察の方が大切です。

古いモノですが、私が学生の時やった
「アルカリ性フォスファターゼによるp-ニトロフェニルリン酸...続きを読む

Q発光分析と吸光分析

原子吸光法とICP発光分析法を例にとって発光分析と吸光分析の違いを教えて下さい。
短所や長所なども教えていただけたら嬉しいです。

Aベストアンサー

原子吸光:資料を適当な方法で原子蒸気化し、生じた基底状態の原子が、この原子蒸気層を透過する特定波長の光を吸収する現象を利用して光電測光により個々の波長についての吸光度を測定し、試料の元素濃度を測定する方法。

ICP発光:高温の誘導結合(高周波)プラズマの中に試料を噴霧し、励起された原子による個々の波長の発光強度を測定し、試料中の各成分の濃度を測定するもの。

ICP発光の特徴
測定範囲が広い:原子吸光は金属元素に限定されるが、ホウ素・リンなどの定量が可能。原子吸光では充分な感度が得にくい難分解性酸化物を生成するような金属(アルミニウム・モリブデン・バナジウムなど)に対しても充分な感度が得られる。
高感度測定、多元素同時分析が可能
測定濃度範囲が広い
精度が高い

欠点:アルゴンの使用量が多い(値段が高い)
でも、かなり普及していると思いますが。(原子吸光に取って代わっている)


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