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ある特定のタンパク質、ペプチドを抽出する実験ですが
すでに目的のペプチドに対する抗体がある場合の生化学的な手法についての
流れが知りたいです。個々の方法の原理(HPLC,逆相HPLC,PCR,ELISA等)は
把握できるのですが、全体の流れがいまいちイメージできません。
材料を集めるところから配列決定までの流れを教えて下さい。

A 回答 (2件)

直接的な回答ではありませんが、以下の参考URLサイトは参考になりますでしょうか?


「改訂 タンパク質実験ノート」
この本の6章が参考になりますでしょうか?
更に以下の成書があります。
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アフィニティークロマトグラフィーによるタンパ質・…/農林水産省農林交流セ…/1992.10 
アフィニティークロマトグラフィー/笠井献一/東京化学同人/1991.10 
===============================
ご参考まで。

参考URL:http://www.so-net.ne.jp/medipro/yodosha/docs/ser …
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 まあ、目的たんぱくまたはペプチドの性質によってずいぶん違ってしまうのですが、、



 例えば、細胞質酵素をとる場合では、

1)細胞を集めてくる。普通は組織。培養だと集めるのが大変。

2)バッファに懸濁後、ホモジナイズ、遠沈。

3)上清の硫安沈殿。

4)オープンクロマト。普通はイオン交換、疎水、ゲル濾過、アフィニティ、の順番。(いきなりのアフィニティはたいがいうまくいかない。)さらに繰り返すこともあるし、濃縮されてきたら、HPLCも使う。PAGEを使ってもいいから、とにかく単離する。

4’)はなから2D-PAGEで打ち抜く方法もある。抗体があるなら同定しやすい。(ても単一とは限らない、というか普通いっぱい出る。)

5)ペプチダーゼで消化する。逆相HPLCで、ペプチド断片を単離後、エドマン分解で部分アミノ酸配列を決める。

5’)いきなりゲル中でペプチダーゼ消化して、ペプチド抽出後、MALDI-TOFにかけて、PSDのピークから配列を決める。

6)検索して見つかれば終わり。なかったら、mRNAからRTでcDNAを作って、アミノ酸配列から作ったプライマーで増やして、シーケンス。さらに3-、5-方面に伸ばして、全長を決める。

 という感じではないでしょうか。

 さらに詳しくは、羊土社の無敵シリーズのたんぱくとか遺伝子とかにのってると思うので買ってね。(他の会社も可。)
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