定量RT-PCRのスタンダードについて

定量RT-PCRのスタンダードについて
抽出したプラスミドの濃度からコピー数を算出し、定量RT-PCRのスタンダードに用いています。
ただ濃度の測定したときの吸光度が低いので、測定誤差の影響が大きいように感じています（測定に用いている分光光度計は70μlキュベットしかなく、サンプルを10倍に希釈して測定しています）。

そこでプラスミドをM13プライマーでPCRをかけて、増幅産物をスタンダードに利用しようと思っています。
このような場合、何か注意点はありますでしょうか？
やはり増幅産物の精製は必要でしょうか？

またグリセロールストックの大腸菌に直接PCRをかけてスタンダードに用いるのは強引でしょうか？

ご意見、アドバイスを頂けると助かります。

No.4 ベストアンサー 回答者： otx 回答日時： 2010/04/25 14:44

よくわからないばかりで恐縮ですが、

質問者さんはどの程度qPCRをやってこられて勉強されていますか？
どうも私と話が通じていない感がありあす。

qPCRではコントロールをどうおくかで相対定量になるか、絶対定量になるのか
が決まります（というか、どっちをしたいかでコントロールを何にするか決めます）。

まず、見たいものがmRNAの発現量である場合、
絶対定量をするためには、自分で作成したmRNA（量をきちんと定量したもの）をコントロールとします。
そのRNAを目的mRNAと混ぜて逆転写反応を経てリアルタイムPCRを行なわなければなりません。
わかりますか？
こうしないと、絶対定量は出来ないわけです。
なぜなら、目的mRNAの逆転写の効率とその後のPCRの効率をモニターしなければ
絶対定量出来ないからです。
上記の方法をやると、自分で作ったRNAは最初に量がわかっているわけですから、
それと比較して目的のmRNAの量がcopy数でわかる絶対定量になるわけです。

一方、mRNAの相対定量をするには、自分の複数のサンプルの中に同じ量含まれているであろう
mRNAをコントロールとして設定します。この時、よく使われるのがハウスキーピング遺伝子です。
ハウスキーピング遺伝子の量をリアルタイムPCRで比較して同じくらいの量と確認するか、
量の違いを補正して確認し、その量と比較して相対的に目的遺伝子を発現量を定量します。
これが相対定量です。

これは典型例です。実際、質問者さんの実験系はよくわかりません。
想像で言いますが、目的遺伝子の量を比較する物差しとして
プラスミドに組み込んだ目的遺伝子（加えた量を把握している）のPCRの増幅を使っているのでしょうか。
（これは正確には絶対定量ではないと思います）
その場合、少なくとも反応系は同じでなければいけないと思います。

つまり、
反応液に、かたや目的遺伝子はDNAなりRNAを加えるのに、
プラスミド（コントロール）は大腸菌を加えるのであれば、
PCRの反応条件として全く違うことになりませんか？

もう少しリアルタイムPCRで、実際自分は何をやっているのか
自分の目的を考えたときに、それであっているのか？
考えた方がいいと思います。

この回答へのお礼

度々お答え頂き恐縮です。

何度も書いているつもりですが、質問の本題はプラスミドの精製と濃度測定についてご意見をお聞きしたかったのです。

たまたま抽出したプラスミドをリアルタイムPCRに利用する機会が多かったので、質問の文言に入れてしまいましたが、PCR反応云々についてお聞きしたいわけではありません。

言葉の定義等、非常に重要なのはよくわかります。
おそらく指導的な立場にいらっしゃる方ですよね。基本計画を重視してのご回答だったと思いますが、どうも話が伏線にそれてしまいますので、やりとりはこれで終了にしたいと思います。

最後に・・、
>反応液に、かたや目的遺伝子はDNAなりRNAを加えるのに、
>プラスミド（コントロール）は大腸菌を加えるのであれば、
>PCRの反応条件として全く違うことになりませんか？
当方に誤解を招く表現があったかもしれませんが、さすがにリアルタイムPCRのスタンダードに直接大腸菌は入れたりは致しません。

お礼日時：2010/04/25 19:42

No.3 回答者： otx 回答日時： 2010/04/23 11:46

よく混乱するので、私はReverse Transcription-PCRのことをRT-PCRと言い

リアルタイムPCRは定量にしか使わないので、Quantitative PCR、qPCRと言います。

ちなみに（半）定量RT-PCRという方法もあるので(RTはReverse Transcription)、
なおさら混乱します。

それで、私も勘違いしていたみたいで、
質問者さんはリアルタイムPCRのことをおっしゃっていたのですね。

リアルタイムPCRにおいてのスタンダードと言っても、
自分の実験系でよく考えて選ぶ必要があります。

あず、目的ですが、
発現しているRNAの量を見たいのか？
存在するDNAの量を見たいのか？

そして、絶対定量をしたいのか？
相対定量をしたいのか？

これによって決まります。

この回答へのお礼

ご回答ありがとうございます。

当方が行っている反応系は、分子量が明確で分子量を算出することができるベクターに組み込んだ核酸分子を人為的に作製して、検量線からコピー数を求めているので、絶対定量になります。

目的はRNA（cDNA）、DNAどちらも候補としています。

ただ今回お聞きしたかったのはPCR反応系の内容ではなく、あくまでもクローニングで作成したプラスミドの効率的かつ正確な濃度測定方法です。

大腸菌グリセロールストックから培養を行い、プラスミドを抽出して濃度測定をする方法ではなくて、大腸菌に直接PCRを行い、挿入した核酸分子＋αの領域を増幅したものを濃度測定に利用したいと思っています。

実験的には問題がなかったのですが、注意点等がありましたらアドバイスを頂きたく質問させてもらいました。

お礼日時：2010/04/24 08:58

No.2 回答者： otx 回答日時： 2010/04/22 17:26

イメージできないことがあります。

通常、組織や細胞に発現している遺伝子を定量RT-PCR（この場合半定量ですが）で発現量等を比較する場合、
細胞数や組織量のトータルが同じであるということを、
ハウスキーピング（どの細胞も発現虜が同じだろうと思われる遺伝子）などのバンドが同じように出る条件下で
目的遺伝子のバンドの濃さを比較するという作業かと思います。

そこにきて、

>ターゲットはヒトで、House Keeping GeneやCancer Marker

ということと、

＞スタンダード作成に「グリセロールストック大腸菌の培養→プラスミド抽出→DNA濃度測定→コピー数算出

この２つのことが、私の中でリンクできません。
どういうことでしょうか？

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
表現がわかりにくく、申し訳ありません。

ハウスキーピングや目的遺伝子の定量時に、予定増幅産物の塩基配列を挿入したプラスミドの希釈系列をスタンダードとしてコピー数（copy/μl）を求めています。

最終的にハウスキーピングと目的遺伝子の比による値補正を行っていますが、測定はあくまでもプラスミドのコピー数を基準に求めています。

今回お聞きしたいことは定量時に用いるプラスミドの濃度を簡便にかつ正確に求める方法になります。

当方の施設では電気泳動による濃度測定は目視でしか行えず概算値となるため、比色による数値データが理想です。

お礼日時：2010/04/23 07:33

No.1 回答者： otx 回答日時： 2010/04/21 08:21

何に発現している遺伝子で、どのような方法で

定量RT-PCRをしようとしていらっしゃるか書いた方がいいかと思います。

この回答への補足

回答ありがとうございます。
ターゲットはヒトで、House Keeping GeneやCancer MarkerをSYBR Green系で検出しています。
またVirusの定量も行っています。

現在はスタンダード作成に「グリセロールストック大腸菌の培養→プラスミド抽出→DNA濃度測定→コピー数算出」としています。
可能であれば「グリセロールストック大腸菌のM13によるPCR→DNA濃度測定→コピー数算出」にしたいと考えています。

一般論・経験論等、ご意見を聞かせて頂けると幸いです。

補足日時：2010/04/22 06:47