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ウェスタンブロットで、ノンスペとブロードなバンドに悩み中

動物の組織をサンプルとしたWBを行っているのですが、
目的のバンドにブロード(スメア)なノンスペのバンドが被ってしまって困っています。
このノンスペバンドを無くして目的のバンドのみを検出するいい方法はないでしょうか?

A 回答 (2件)

ECL Plusは高感度な分、反応させすぎたりしてノンスペが出やすい印象があります。

しかし、条件検討されているようなので変わらないかもしれないですね。ノンスペはよくある話なのでブロッキングを変えてみるとかいろいろあるみたいです(過去レスにもありました)。言いたいことが言えるのであればあまり気にしないというのもありかと。。
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この回答へのお礼

ブロッキングも、skim milkとBSAで検討したんですが、全く変わらずでした・・・。
流すタンパク量を1/3にしたら、ブロードなバンドはなくなったのですが、相変わらず出てくるノンスペ・・・。
ちょうど目的タンパクに被るので、邪魔でしょうがないです。

お礼日時:2010/06/12 14:25

まず抗体を変えてみるのがよいと思います。

あとはサンプルを超遠心や限外ろ過で分画してみる、ECL pulseを普通のやつに変えてみる、でしょうか。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
抗体はこの問題のやつに関しては2社のでやってるんですが、どっちも出てくるんです。
他に、4~6種類くらい別のタンパクの抗体でも出てくるので、厄介極まりないんです。
こっちは目的タンパクの位置と被らないので問題ないんですが。

超遠心と限外ろ過はしたことないので・・・。
ECL plusを普通のというのは、一つ下のグレードのやつってことですか?
一応、ECL plusを混ぜた後に蒸留水で×2、×3希釈とかしてもダメだったので、諦めてたのですが。

お礼日時:2010/06/12 09:58

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Aベストアンサー

> タンパクの立体構造をほぐすためにも加熱処理は必須ですよね
これについては諸説あって・・・あまり大きな声では言えないのですが、
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Aベストアンサー

ブロードとブロードニングは同じだと思いますが
両方とも泳動に対して水平方向に広がっている、という意味です。
両端が上がっている場合はスマイリング(Smiling)とも言います。
サンプルの精製を良くする、泳動bufferの組成を検討することで解消します。
タンパク質のPAGEなどで脱塩が不十分だったり、pHがあっていないと泳動が乱れブロードになることがあります。

一方、スメアは意味が全く違います。
通常1本のバンドとして確認するはずのものが、
分解による断片化などで尾を引くように縦方向に広がり、
一本に見えなくなる現象です。
サンプル調整の段階で泳動した物質の消化酵素のコンタミなどが考えられます。
Total RNAの抽出の際にRNaseがコンタミして断片化したりすると、
泳動でスメアになることがあります。

もともと複数本のバンドがでる場合は、ラダー(ladder;はしご)と表現します。
ラダーではあっても、1本ずつのバンドははっきり見えるはずです。
ラダーでありかつスメアな場合もあるわけです。
ラダーの例としてはPCR増幅したDNAがノンスペシフィックな増幅がかかっており、複数本のバンドが見えるような場合につかったりします。

それぞれ似た様な言葉ですがさしている現象は違いますし、
対処法、原因も違います。
使い分けてください。

SDS-PAGEに関してはGEのハンドブックが参考になります。
http://www.gelifesciences.co.jp/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=1009
この頃は有料になりましたが。

ブロードとブロードニングは同じだと思いますが
両方とも泳動に対して水平方向に広がっている、という意味です。
両端が上がっている場合はスマイリング(Smiling)とも言います。
サンプルの精製を良くする、泳動bufferの組成を検討することで解消します。
タンパク質のPAGEなどで脱塩が不十分だったり、pHがあっていないと泳動が乱れブロードになることがあります。

一方、スメアは意味が全く違います。
通常1本のバンドとして確認するはずのものが、
分解による断片化などで尾を引くように縦方向に広が...続きを読む

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>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

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★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるための指数表記のことですよ。
・よって、『2.43E-19』とは?
 2.43×1/(10の19乗)で、
 2.43×1/10000000000000000000となり、
 2.43×0.0000000000000000001だから、
 0.000000000000000000243という数値を意味します。

補足:
・E+数値は 10、100、1000 という大きい数を表します。
・E-数値は 0.1、0.01、0.001 という小さい数を表します。
・数学では『2.43×10』の次に、小さい数字で上に『19』と表示します。→http://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%8C%87%E6%95%B0%E8%A1%A8%E8%A8%98
・最後に『回帰分析』とは何?下の『参考URL』をどうぞ。→『数学』カテゴリで質問してみては?

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/%E5%9B%9E%E5%B8%B0%E5%88%86%E6%9E%90

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるた...続きを読む

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オキシドールの成分に 過酸化水素(H2O2)2.5~3.5W/V%含有と記載されています。W/V%の意味が分かりません。W%なら重量パーセント、V%なら体積パーセントだと思いますがW/V%はどのような割合を示すのでしょうか。どなたか教えていただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。

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つまり、全溶液100ml中に何gの薬液が溶けているか?
ということです。
w/v%のwはg(グラム)でvは100mlです。

QBSA溶液の作り方。

(1)1%のBSA溶液を作る場合、100mlの純水に1gのBSAを加えればいいのでしょうか?
(2)スライドグラスにBSAをコートすると精子がくっつきにくくなると聞いたのですが、なぜでしょうか?BSAにはどのような作用があるのでしょうか?

Aベストアンサー

(1)だけですが、
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また、溶液を作るときはかき混ぜるとダマになったり泡だったりするので、水の上にBSA粉末を乗せて静置して溶けるのを待ちます。


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