出産前後の痔にはご注意!

 アミノ酸の構造類似体、アミノ酸アナログについて分からない事があります。ぜひ教えてください!LーリシンのアナログであるAECとL-トレオニンの協奏フィードバックによってアスパラギン酸キナーゼが阻害され、よって菌の生育もまた阻害されますが、この生育阻害がL-リシンを添加することで回復するのはなぜなんでしょうか・・・?トレオニンがそれまでAECのみを認識して協奏阻害を行っていたところに、L-リシンが加わり、トレオニンの認識機構(?)のようなものがうまく働かなくなったのでしょうか。L-リシンが加わったことで阻害はより強くなりそうな気がしてしまいます・・・ご存知の方、宜しくお願いします!!

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A 回答 (1件)

 『アスパラギン酸キナーゼが阻害』されると,何故『菌の生育もまた阻害』されるのでしょうか?



 下記ページの記載によると,『アスパラギン酸キナーゼは,アスパラギン酸を生合成の出発物質とするリジン,メチオニン,スレオニンの合成系の初発反応を触媒する酵素』の様ですね。

 とすると,この酵素が阻害される事で,これらアミノ酸が不足するために,成育阻害が起こるのではないでしょうか?

 であれば,不足するアミノ酸を補う事で,生育阻害が回復すると考えられます。

 いかがでしょうか。

参考URL:http://yu-ki.ch.a.u-tokyo.ac.jp/yoshi2/ys-n.htm
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この回答へのお礼

 ありがとうございました!教えていただいたURL,参考にさせていただきます。確かに生産されているアミノ酸はリシンを含め生育に必要なものなのですが、リシンは菌体内に存在すれば、消費され、生育は阻害される方向に向かいそうなのですが・・・すこーしややこしいですね(笑)

お礼日時:2003/08/01 19:09

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QcDNAのクローニングについて

抗体Aと結合するタンパク質をコードする遺伝子(cDNA)をクローニングする方法を教えてください。

実はこれはある問題で、「PCR、アミノ酸配列、プライマー、精製、データベース」の用語を用いて説明するように書いてあるのですが、インターネットで「cDNAクローニング」といれて検索しても、詳しく中身が書いていなくて、よく分かりません。

自分なりに考えてみると、「タンパク質を精製して、そこからcDNAを抽出し、それをプライマーを用いてPCRで増幅させ、塩基配列を調べて、・・・。」
問題に答えているのか、合っているか分からないですし、行き詰まってしまいます。
タンパク質を精製する方法や、タンパク質からcDNAを抽出する方法があるのかも分かりません。

長々と書いてしまいましたが、よろしくお願いします。

Aベストアンサー

cDNAって何だかご存知ですか?cDNAというのは、細胞内のmRNAを逆転写酵素(reverse transcriptase)をもちいて、その相補的なDNAを作ったときのそのDNA鎖のことです。通常の転写はDNA→RNAの順ですが、この場合はRNA→DNAなので「逆」転写なわけです。「相補的」にあたるcomplementaryの頭文字をとってcDNAというのです。

さて、具体的な方法ですが、細胞内からmRNAを抽出・精製してきます。この段階ではまだいろいろなタンパク質をコードしているmRNAが混ざっています。抗体Aをコードする遺伝子の塩基配列を、データベースを使って調べます。そして、その塩基配列からプライマーを作成して、逆転写酵素に、目的のDNAだけを作らせます。次に、別のプライマーを入れてPCRにかければ、そのDNAのみがどんどん複製されて、目的の遺伝子がクローニングされます。

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Q栄養要求性変異株について

こんばんわ。何度も質問していまいすいません。

栄養要求性株は、たとえばグルタミン酸要求性株だったら、グルタミン酸を必要とするもののことですよね?
栄養要求性変異株とはどんなもののことを言うんですか?
あまり生物に詳しいほうではないので、出来るだけ初心者でも分かるように説明していただけるとありがたいです。お願いします。

Aベストアンサー

 主に大腸菌についての言葉のようですが、普通の大腸菌はN(窒素)源としてアンモニア、C(炭素)源としてグルコースがあれば増殖できます(原栄養株=野生株)。この野生株がアミノ酸、プリン、ピリミジン、ビタミンなど特定の栄養素が無いと増殖できない変異を起こしたものを栄養要求変異株、というようです。
 つまり、いわゆる普通の培地に、何らかの栄養成分を添加してやらないと増殖できない菌株は全て栄養要求性(変異)株、ということができるようですね。

Q塩基の置換?転位?変異?

素人の生物好きです。
 遺伝子の塩基が突然変異である塩基がある塩基に代わった場合、置換、転位、変異、、どの用語が正しいのでしょうか。
 Transitionという英語がありますが、これは転位でしょうか? この3つの意味の異同がわかりません。
 どなたかわかりやすく正確に教えて下さい。さんこうになるホームページをご存じでしたら教えてください。

Aベストアンサー

>置き換わるというのは、別のプリンやピリミジンがきて置き換わるのか、分子構造が何らかの原因で変わって結果的に別のプリンやピリミジンに換わったのかどちらなんでしょうか。

DNAを複製する酵素が100万~1000万塩基くらいに1塩基くらいの割合で間違った塩基をつないでしまいます。間違った塩基が取り込まれた場合それを修復する酵素があるので100億塩基に1塩基くらいの間違いに治められています。非常に低い確率ですが、正常な状態でも塩基置換は起こります。

さらに変異原が作用した場合は頻度はもっと高くなります。
たとえば、化学変異原が塩基を修飾した鋳型をもとに複製が行われた場合、修飾された塩基には間違った塩基が相補対を作るため塩基置換が起こります(この機序はtransitionの例でしか見つかっていません)。

No. 1で書いた塩基置換の2分類「transition」と「transversion」は、こういう場合をこう呼びましょうと定義されたものです。そして転移(転位ではなく)と転換はそれらの訳語としてこういいましょうと合意されたものです。
一般的意味や語感で、生物学上の意味やそれらが起こる機構を誤解しないようにしましょう。

>置き換わるというのは、別のプリンやピリミジンがきて置き換わるのか、分子構造が何らかの原因で変わって結果的に別のプリンやピリミジンに換わったのかどちらなんでしょうか。

DNAを複製する酵素が100万~1000万塩基くらいに1塩基くらいの割合で間違った塩基をつないでしまいます。間違った塩基が取り込まれた場合それを修復する酵素があるので100億塩基に1塩基くらいの間違いに治められています。非常に低い確率ですが、正常な状態でも塩基置換は起こります。

さらに変異原が作用した場合は頻度はもっと...続きを読む

QpUCベクターについて

製品のサイトを見てもよく分からなかったので詳しい方いましたら
お願いします。

pUC系(pUC18)はlacプロモーターを有していますが、
これはIPTGで誘導されるのですか?

ベクターマップにlacIが見当たらないのです。
pUC系のベクターにラクトースオペロンが存在するのかが
分かりません。

よろしくお願いします。
ちなみに青白判定は行いません。

Aベストアンサー

ANo.1の回答には一部間違いがありますので勝手に補足させてもらいます。
そもそも、pUCタイプベクターは青白選択を行うために開発されたベクターですので、まずはその原理を理解されるのがよろしいかと。

まず、pUCタイプベクターなど、α-complementationによる青白選択を行うためのベクターには、lacプロモーター(lacP)、lacオペレーター(lacO)、そしてlacZ遺伝子のα-flagment部分が乗っています。
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0329

また、青白判定を行う際にホスト株から野生型lacZが発現しては困るので、このような目的に使うホスト株(DH5α、JM109など)は通常ラクトースオペロンを欠失させています。この遺伝子型は出典によって異なりますがおおよそΔ(lac-proAB)やΔ(lacZYA-argF)U169などと表現されます。
ただしこれだとlacZ Ω-flagmentが発現していないので、別途ゲノム上(DH5α)、またはF'因子上(JM109)にlacZ Ω-flagmentを恒常的に発現させるための配列を導入してあります(遺伝子型:lacZΔM15)。
さらに、JM109などは、未誘導時のベクター上lacプロモーターからの発現を強力に抑制するよう、F'因子上に恒常発現変異型lacIを配置してあります(lacIq)。

IPTGによる強制発現誘導は、ゲノム上由来、ベクター上由来を問わずlacIqという遺伝子型を持つ大腸菌で特に有効です。というかlacIqによるlacプロモーターの発現抑制を解除するために使用します。JM109などのlacIqを持つホスト株にpUC18を形質転換し、IPTGを含む培地中で培養すると、ベクター上のlacプロモーターからの発現が起こり、培地中にX-galが存在すれば青くなります。逆にlacIq遺伝子型を持たないDH5αでは、pUC18を形質転換しX-galのみを含む培地上に播種するだけでコロニーは青くなります。

以上を踏まえ、質問者さんに対する直接の回答としては
「lacO領域を持っているのでIPTGによって発現誘導はかかる。ただし、lacIq遺伝子型が無い場合はIPTG無しでもそれなりに発現する」
となります。

ANo.1の回答には一部間違いがありますので勝手に補足させてもらいます。
そもそも、pUCタイプベクターは青白選択を行うために開発されたベクターですので、まずはその原理を理解されるのがよろしいかと。

まず、pUCタイプベクターなど、α-complementationによる青白選択を行うためのベクターには、lacプロモーター(lacP)、lacオペレーター(lacO)、そしてlacZ遺伝子のα-flagment部分が乗っています。
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0329

また、青白判定を行う際にホスト株から...続きを読む

QNMR装置の○○MHzの表記の意味

 最近のNMR装置は、普通その性能を表すのに、○○MHz(270 MHzや400 MHzな
ど)と呼ばるようですが、この意味は何でしょうか。参考書には、よく共鳴周
波数の値だ、と書いてありますが、どうも磁石の強さを表しているように思い
ます。確かに、MHzは周波数の単位ですし、磁場(磁束密度)の単位はG(ガウス)
やT(テスラ)となるはずですが、周波数がNMRの装置の性能を決めるのでしょう
か。NMRに詳しい方のご意見をお伺いしたいです。よろくお願いします。

Aベストアンサー

まず,NMR の化学シフトは非常に小さいのです.
化学シフトのおこる原因は,核の周りにある電子による磁気遮蔽です.つまり外部磁場と核の感じる実効磁場の差が化学シフトを生むわけです.
すでに挙がっている式により,磁場と共鳴周波数は比例関係にあります.そもそも NMR は磁場下での核のエネルギー分裂によるので,磁場が強いほど分裂幅が大きく,当然共鳴エネルギー (吸収される電磁波の光量子のエネルギー) も大きくなり,つまり電磁波の振動数が高くなる,ということになります.
FTを使ったパルスNMRより,古典的なNMRの方がわかりやすいと思いますので,そちらで話をしますが,この共鳴条件を調べるためには磁場か周波数を連続的に変化させてどの条件で共鳴吸収がおこるかを調べればいいことになります.ただし,マイクロ波程度の波長になると周波数を微妙に,しかも安定かつ正確に変えるのは簡単ではありません.一定の周波数で安定に作るのでさえ,結構めんどうなのです.そこで,周波数は固定にします.その代わりに磁場を変えます.といっても,ごくわずかな変化を与えるので,通常の磁場を与える電磁石に流す電流を直接操作することはしません.こちらは一定電流で安定な強磁場を作っておきます.そして,それとは別に磁場を微小変化させるための別の弱い電磁石を組み込み,こちらを操作することで磁場をわずかに変化させるのです.この磁場の変化を精密に測定するには,もとの磁場が強ければ強いほど,同じだけの磁場変化でもより分解能の高い測定をしたことになるのです.100に対して1変化させるのと10000に対して1変化させることの違いです.同じ1のもつ重みが違うわけです.
ということで,共鳴磁場を強くする=共鳴周波数を高くすることが,測定の分解能を上げるためには最も直接的であるのです.

まず,NMR の化学シフトは非常に小さいのです.
化学シフトのおこる原因は,核の周りにある電子による磁気遮蔽です.つまり外部磁場と核の感じる実効磁場の差が化学シフトを生むわけです.
すでに挙がっている式により,磁場と共鳴周波数は比例関係にあります.そもそも NMR は磁場下での核のエネルギー分裂によるので,磁場が強いほど分裂幅が大きく,当然共鳴エネルギー (吸収される電磁波の光量子のエネルギー) も大きくなり,つまり電磁波の振動数が高くなる,ということになります.
FTを使ったパルスNMR...続きを読む

Q同じタンパク質なのに分子量が違うのはナゼ??

今SDS-PAGEを扱っています。
あるタンパク質についてなのですが、
SDS-PAGEを用いて分子量を測定したら3万になり、
変性させずにゲル濾過クロマトグラフィーを行うと12万でした。
実験操作がおかしいわけではないと思うのですが、いろいろと調べてみても納得のいく答えが出ません。
このタンパク質についてどのようなことが言えるのでしょうか??
ぜひ教えてください。

Aベストアンサー

SDS-PAGEで測定される分子量はあくまでゲルでの移動度により判断されるものなので、実際の分子量とは違うことが多いです(だから単位にもkDが使われています)。変性条件下と未変性でのゲルでの移動度の違いは、そのタンパク質が3万のサブユニット4つの4量体からなる場合もありますし、また、単量体のたんぱく質でも、未変性の状態ではS-S結合により複雑な立体構造を形成しているために、ゲルの網目を通りきれずに、大きい分子量として出てくる場合もあります。

Q酵素の比活性

 前にも似たような質問をしたのですが、よく分からないのでもう一度させていただきます。
 酵素の比活性でどのようなことが分かるのでしょうか?出来れば詳しくお願いします。

Aベストアンサー

比活性というのは、タンパク質あたりの活性と定義されます。
今、アルコールを酸化する酵素を測定するために肝臓をすりつぶしたとします。肝臓には数千種類のタンパク質がありますが、その中でアルコールを酸化する酵素はごく一部です。他のタンパク質は全然別の酵素活性を持っていたり、酵素ではないタンパク質だったりします。ですから、タンパク質あたりの活性を計算すると、分母が大きいから、比活性は小さい値がでます。ところが精製操作を行って、アルコールを酸化する酵素以外のタンパク質が取り除かれれば、分母は小さくなりますから、比活性は大きくなります。その大きくなり具合は、目的の酵素以外のタンパク質を取り除く操作、つまり精製操作の指標になります。完全に精製されれば、それ以上は精製しようとしても、比活性が高くならないはずです。誰かがある酵素をすでに結晶化して、そのような純粋な酵素の比活性を報告していれば、それとの比較で、自分の行っている精製操作がよいか悪いかがわかります。
とはいっても精製した酵素が一部失活すると、たとえば、半分が失活すると、タンパク質としては全部残っていますから元の値のままですが、活性は半分になったので、比活性は半分に低下します。つまり酵素の変性による失活の指標にもなります。

比活性というのは、タンパク質あたりの活性と定義されます。
今、アルコールを酸化する酵素を測定するために肝臓をすりつぶしたとします。肝臓には数千種類のタンパク質がありますが、その中でアルコールを酸化する酵素はごく一部です。他のタンパク質は全然別の酵素活性を持っていたり、酵素ではないタンパク質だったりします。ですから、タンパク質あたりの活性を計算すると、分母が大きいから、比活性は小さい値がでます。ところが精製操作を行って、アルコールを酸化する酵素以外のタンパク質が取り除かれれ...続きを読む

Qウィンクラー法とアジ化ナトリウムについて

ウィンクラー法という、水中の酸素を亜マンガン酸で固定させ、KIと硫酸酸性で反応させて生成したヨウ素をチオ硫酸ナトで適ていするという方法があります。ここで、硫酸酸性にする理由はなんでしょうか。また、この方法は還元性物質の存在により、酸素が消費されてしまうので、(ここまでは理解できます)アジ化ナトリウムNaN3を加えて妨害を防ぐそうです。アジ化ナトリウムを加える理由はなんでしょうか。頭悪くてごめんなさい><分かりやすく教えていただければ幸いです。

Aベストアンサー

ウィンクラーのヨウ化カリウム-アジ化ナトリウム変法では、
 1)マンガン塩による溶存酸素の固定
  (Mn(OH)2→Mn(OH)3 ; Mnは溶存酸素によって2価から3価に酸化)
 2)ヨウ素・チオ硫酸塩を使った逆滴定
の二段階の操作を行います。

これは、そのままでは溶存酸素が放出されやすい為、
採水地点から実験室までの移動中に放出されないようにする
必要があるからです。

この1段目の、マンガン塩による酸素固定の反応はアルカリ性で行う必要があります。
一方、2段目の逆滴定では、KIからヨウ素を遊離させるのと、そのヨウ素とマンガンを
定量的に反応させるために、酸性下で行う必要があります。
そのため、『滴定時に』硫酸酸性にします。


また、亜硝酸イオンが共存する場合(→河川水では常時共存)、
溶存酸素によるマンガン塩の酸化が定量的に行われず、
一部の酸素が亜硝酸イオンの酸化(→硝酸イオンに変化)に
使われたりしてしまいます。
これを避ける為、アジ化ナトリウム(→還元剤だが、(測定法の
条件下では)溶存酸素やMn(OH)3を還元しない)を添加し、
亜硝酸イオンを分解してやります。
他の還元剤、例えば亜硫酸塩などでは、溶存酸素と反応したり、
精製させたMn(OH)3まで還元してしまう為、
アジ化ナトリウムを使用する必要があるわけです。

参考URL:http://gakuen.gifu-net.ed.jp/~contents/kou_nougyou/jikken/SubKankyo/7/index.html

ウィンクラーのヨウ化カリウム-アジ化ナトリウム変法では、
 1)マンガン塩による溶存酸素の固定
  (Mn(OH)2→Mn(OH)3 ; Mnは溶存酸素によって2価から3価に酸化)
 2)ヨウ素・チオ硫酸塩を使った逆滴定
の二段階の操作を行います。

これは、そのままでは溶存酸素が放出されやすい為、
採水地点から実験室までの移動中に放出されないようにする
必要があるからです。

この1段目の、マンガン塩による酸素固定の反応はアルカリ性で行う必要があります。
一方、2段目の逆滴定では、KIからヨウ素を遊離...続きを読む

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む


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