よろしくお願いします。大腸菌での異種発現にとりくんでいる学生です。

大腸菌に目的遺伝子を形質転換する場合、
非環状プラスミドではタンパク質は作られないのでしょうか?

いま私がもってるのは目的遺伝子が導入された環状のプラスミドを
インバースPCRしたものです。
インバースPCRは目的遺伝子の一部を削る目的で行ったので、
アンピシリン耐性遺伝子や複製起点はそのまま残ってます。
非環状で、また両端はともに平滑末端です。
forward側はリン酸基がなく、reverse側はリン酸基があります。
PCR後の精製は済んでます。

教官から
"平滑末端の場合は大腸菌が環化のプロセスを行うから、
ライゲーションせずに形質転換していい"、
というよう助言をいただいたんですが、本当に大丈夫か心配です。
いろいろ探してみましたが、そういった記述のある文献はまだ見つけられません。

非環状のプラスミドで発現がうまくいった、またはそういう文献を読んだことのある方、
ぜひお話をお聞かせください。

A 回答 (1件)

理論的にはうまくいくと思います。



ただ、プラスミドがプラスミドらしくあるためには環状(スーパーコイル)である必要があります。

環状であることでori点から「ホスト細胞の染色体と独立して増幅できる」という利点があるからです。

大腸菌を使うってことは、
30分に一回の分裂→猛烈に増える→一緒にプラスミドも増える→タンパクも増える
ということです。

おそらく、形質導入された大腸菌ではタンパク発現できると思います、ただ、リニアのままだとプラスミドが増えないので
タンパクの発現は見かけ上、皆無になると思います。

やるならば、コンピテントセルを100mlくらい使って、たくさんのリニアプラスミドをトランスフォームすれば可能かもしれません。
しかし、現実的ではありません。

さて、大幅に脱線しましたが、教官の仰っていることは嘘ではありません。
ですが、結合する活性はそれほど高くありません。

よって、セルフライゲーションくらいであればポツポツとコロニーが生えると思います。
(それが切れ残りでない保障はありませんが)

しかし、インサートがあるライゲーションであれば、ライゲース処理なければ難しいと思います。

こっそりライゲーションすることをお勧めしますが、バレて怒られるかもしれません。

この回答への補足

ご意見ありがとうございます。

セルフライゲーションは大腸菌が自発的に行うものではなくリガーゼの作用ですよね。

教官に制限酵素処理についても質問していたので処理を省いていいと指示があったのは
ライゲーションではなく制限酵素処理のことだったかもしれません。

アドバイス通り、リガーゼを加えてライゲーションしてから形質転換します。

補足日時:2011/04/14 11:56
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Aベストアンサー

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、それを防ぐ為に穏やかな条件で回収しているのではないでしょうか。

(2)これはエタノール沈殿の条件では、一本鎖、二本鎖に違いはあまりないと思います。

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(4)EDTA等は、仰るようにDNAの安定化の為だと思います。
グルコースは浸透圧のコントロールとして、また後のエタノール沈殿のときにはDNAの共沈剤の効果があると言われています。浸透圧のコントロールとして塩を加えてもよいのですが、塩はDNAと不溶性複合体をつくりますので、最近のプロトコルはglucoseみたいですね(私が学生の頃はEDTA以外特になにも入っていませんでした)。後者はエタ沈の時にグリコーゲンを加える事があるのと一緒ではないでしょうか。

(5)仰るようにタンパク質を完全に除去する為です。目的によっては省略してもよいでしょう。また、フェノクロの後はフェノールを完全に除去するためにクロイソ処理が必須です。

(6)この場合のエタ沈はプラスミドDNAを単離することです。が、sol.3を回収すればタンパク質の分析も・・・できるかも。実際にQIAGENなどからは1本の培養系からDNA、RNA、タンパク質を同時に精製するkitがあります(ありました。今はちょっとわかりません)

(2)と(3)はゲノムDNAのtopologyの問題ですかね。
僕は専門ではありませんので、曖昧です。すみません。

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、そ...続きを読む

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Aベストアンサー

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Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

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そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

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機能不明なので、高次構造が大事かどうかも不明ですが、
ちゃんとしてるにこした事はないと思っています。
こうゆう場合、本などを見ると、

低温で培養してみる
GST等とのfusionに変えてみる
ドメインごとに発現させる

等のことが書いてありますが、下2つは結構大変ですよね。
以上のような可溶化条件の検討に努力を費やしたほうが良いのか
それとも、尿素やグアニジン塩酸のようなもので
強引に可溶化して、リフォールディングに努力を費やした方が良いのか
教えてください。
 

Aベストアンサー

大腸菌での発現はやってみないとわからない....
というのがホントのところだと思います。
お手軽でいいんですけどねぇ。。。

以下は回答ではなく私だったら....
という提案ですので参考までに。

分子量が100kということですので、フルで発現させると
可溶性画分で回収するのは難しいのではないかと感じます。
なので、尿素やグアニジン塩酸で可溶化して、
リフォールディングを行ないつつ、
低温での培養やドメインごとの発現を同時進行します。

もしかしたら、大腸菌以外の発現系だと
あっさりといくのかもしれませんね(笑)。


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