よろしくお願いします。大腸菌での異種発現にとりくんでいる学生です。

大腸菌に目的遺伝子を形質転換する場合、
非環状プラスミドではタンパク質は作られないのでしょうか?

いま私がもってるのは目的遺伝子が導入された環状のプラスミドを
インバースPCRしたものです。
インバースPCRは目的遺伝子の一部を削る目的で行ったので、
アンピシリン耐性遺伝子や複製起点はそのまま残ってます。
非環状で、また両端はともに平滑末端です。
forward側はリン酸基がなく、reverse側はリン酸基があります。
PCR後の精製は済んでます。

教官から
"平滑末端の場合は大腸菌が環化のプロセスを行うから、
ライゲーションせずに形質転換していい"、
というよう助言をいただいたんですが、本当に大丈夫か心配です。
いろいろ探してみましたが、そういった記述のある文献はまだ見つけられません。

非環状のプラスミドで発現がうまくいった、またはそういう文献を読んだことのある方、
ぜひお話をお聞かせください。

A 回答 (1件)

理論的にはうまくいくと思います。



ただ、プラスミドがプラスミドらしくあるためには環状(スーパーコイル)である必要があります。

環状であることでori点から「ホスト細胞の染色体と独立して増幅できる」という利点があるからです。

大腸菌を使うってことは、
30分に一回の分裂→猛烈に増える→一緒にプラスミドも増える→タンパクも増える
ということです。

おそらく、形質導入された大腸菌ではタンパク発現できると思います、ただ、リニアのままだとプラスミドが増えないので
タンパクの発現は見かけ上、皆無になると思います。

やるならば、コンピテントセルを100mlくらい使って、たくさんのリニアプラスミドをトランスフォームすれば可能かもしれません。
しかし、現実的ではありません。

さて、大幅に脱線しましたが、教官の仰っていることは嘘ではありません。
ですが、結合する活性はそれほど高くありません。

よって、セルフライゲーションくらいであればポツポツとコロニーが生えると思います。
(それが切れ残りでない保障はありませんが)

しかし、インサートがあるライゲーションであれば、ライゲース処理なければ難しいと思います。

こっそりライゲーションすることをお勧めしますが、バレて怒られるかもしれません。

この回答への補足

ご意見ありがとうございます。

セルフライゲーションは大腸菌が自発的に行うものではなくリガーゼの作用ですよね。

教官に制限酵素処理についても質問していたので処理を省いていいと指示があったのは
ライゲーションではなく制限酵素処理のことだったかもしれません。

アドバイス通り、リガーゼを加えてライゲーションしてから形質転換します。

補足日時:2011/04/14 11:56
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