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電気泳動するときにSDSを使う理由を教えてください。 SDSを入れなかったらどうなるんですか?実験は失敗しますかね。 宜しくお願いします。

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A 回答 (1件)

ネイティブPAGEと呼ばれる電気泳動になります



SDSはタンパク質を変成させてマイナスに帯電させることで分子量のみで分離する方法ですが
SDSを入れなければタンパク質そのものの構造と電気的特性で分離することとなります
私は学生時代の実験ではタンパク質の精製のためにネイティブPAGEをずっとやってました
等電点電気泳動などもこれを使ってやったとおもいます

ただ、分子量で分離できるSDSと違ってどこにバンドがでるかはわかりませんけどね
だから分子量でバンドを見ようとしているなら実験は失敗ですね
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この回答へのお礼

なるほど。よくわかりました。
本当にありがとうございました。

お礼日時:2011/04/19 21:48

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QSDS電気泳動について教えて下さい。

SDS電気泳動ってどういうものなのでしょうか?
検索してみるとタンパク質の変性を加えて用いるということは分かったのですが、
それ以外のことは分かりません。
どなたか詳しい方教えて下さい。 

Aベストアンサー

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲルの「網目」を通過させる(大きいサイズほど流れにくく、小さいサイズのタンパク質は流れやすい)
というものです。網目を通過しやすいかしにくいかでタンパク質の長さを測定します。結果として、ゲルの下の方には小さいタンパク質が、上の方には大きいタンパク質がきます。

SDSで変性させる理由ですが、タンパク質を直鎖状にすることです。タンパク質はその機能を発揮するために特有の立体構造(疎水結合やジスルフィド結合などを利用して)を形成します。タンパク質をそのまま泳動すると、ポリアクリルアミドゲルの「網目の通りやすさ」はタンパク質の長さだけに影響されず、タンパク質の形状(立体構造)にも影響を受けます。

SDS-PAGEを行う場合の多くは、タンパク質の長さだけを知りたいので、タンパク質の立体構造に影響される電気泳動は望ましくありません。そこで、SDSでタンパク質を直鎖状にして電気泳動します。

では、SDSをいれるとなぜ、タンパク質が直鎖状になるか、です。SDSは親水基と疎水基の両方をもつ化合物です。そして、その親水基は負(マイナス)に荷電しています。

タンパク質の立体構造はアミノ酸残基(アラニン、グリシン、リジン、トリプトファン・・・)の性質(特にアミノ酸残基がもつ電荷)の影響を大きく受けます。SDSがタンパク質に作用すると、SDSの疎水基側がタンパク質に親水基側が溶媒側に結合します。このタンパク質に結合したSDSの親水基(マイナスに荷電)がタンパク質を構成する様々なアミノ酸の特性を打ち消してしまいます。結果として、SDSが結合したタンパク質はアミノ酸残基の影響をうけられなくなり直鎖状になります。

また、このようにSDSが結合したタンパク質はマイナスに荷電しますので、電気泳動をするとタンパク質(とSDSの複合体)はマイナスからプラスの方へ泳動されていきます。

最後に、立体構造に大きな影響を与えるジスルフィド結合に関してです。このジスルフィド結合はSDSによって壊されません。そこで、多くのSDS-PAGEを行う場合は、SDSと共に2-mercaptoethanolやDTTといったジスルフィド結合を壊す還元剤で処理したタンパク質を電気泳動します。

なお、立体構造も含めて解析したい場合は、Native PAGEと呼ばれる方法で電気泳動を行います。

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲ...続きを読む

Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

QゲノムDNAライブラリーとcDNAライブラリーの違い

ゲノムDNAライブラリーとcDNAライブラリーの違いって何でしょうか?

また、これらのライブラリー中にクローン化されている遺伝子の構造の大きな違いって?

よろしくお願いします

Aベストアンサー

まず、DNA=遺伝子ではないということと、「遺伝子<ゲノム」なのを考えればわかると思いますが、ゲノムライブラリーは、ゲノムを制限酵素で切断したもの全てをライブラリー化したものです。つまり、遺伝子だけでなく、遺伝子ではない部分も取り込みます。
それに対してcDNAライブラリーは、mRNAからcDNAを合成し、ライブラリー化するので、そこには、遺伝子のみが含まれます。
つまり、遺伝子のタンパク発現・機能解析を行いたい時に、cDNAライブラリーを用いる場合が多いです。
クローン化されているものに、違いはありませんよ。ミューテーションを除いて、全く同じものが複製されます。

QSDS-PAGE 移動度について

こんにちは!!
大変初歩的な質問で申し訳ないのですが、ご回答お願いいたします。

大学でタンパク質の精製実験をし、チトクロムCの純度が上がっていくのを確認するためにSDS-PAGEをおこないました。
SDS-PAGEでは、マーカーのRf値と分子量の対数値をプロットしたグラフを作成し、そこから分子量未知の試料の分子量を求めるということは理解しています。

Rf値は、ブロモフェノールブルーの移動度を1とした各試料の相対移動度であるということですが、ブロモフェノールブルーの移動度はどこからわかるのでしょうか。
SDS-PAGEの結果のカラーコピーがあるのですが、これをものさしで測ってやればいいのでしょうか?(>_<)
ご回答お願いします。
あと、試料は、タンパク質精製のいろいろな段階からとったもので3種類あります。これらの試料から、チトクロムCの純度を求めるのですが、これはSDS-PAGEで染色されたすべての部分の総分子量(1)とチトクロムCの分子量(2)をもちいて、
(2)/(1)で求めればいいのでしょうか?

いろいろな文献を読んでもわかりませんでした。
大変初歩的で申し訳ないですが、ご返答よろしくお願いします。

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Aベストアンサー

実習みたいな中身だけど、それなら担当教官に訊けば良いと思うが・・・?

>ブロモフェノールブルーの移動度を1とした各試料の相対移動度であるということですが、ブロモフェ
ノールブルーの移動度はどこからわかるのでしょうか。
意味がよくわかりませんが、ブロモフェノールブルーがどれだか解らないのですか?

>SDS-PAGEの結果のカラーコピーがあるのですが、これをものさしで測ってやればいいのでしょうか?
はい、そうです。普通はゲル上端からの距離を測ります。
ところで、バンドには太さがありますね。バンドの上端、真ん中、下端間での距離のうちどこが良いと思
いますか? 全てに当てはまるわけでは無いのですが、下端をおすすめします。なぜかというと、タンパ
ク質量をどんどん増やしてみます。するとバンドはどんどん太くなり、それにつれて、真ん中と上端の位
置はどんどん上がっていきますが、下端の位置はほぼ同じです(かなり大量になるともちろん下がって
きます)。比較的タンパク質量に依らずたいてい同じ位置になるので(ときどきあれ?というのはあるの
ですが)、下端が一番おすすめです。

>タンパク質精製のいろいろな段階からとったもので3種類あります。これらの試料から、チトクロムCの
純度を求めるのですが、これはSDS-PAGEで染色されたすべての部分の総分子量(1)とチトクロムC
の分子量(2)をもちいて, (2)/(1)で求めればいいのでしょうか?
全然違います。どのくらい純度があるかというのですから、チトクロムCのタンパク質量(重さ、つまり単
位はmgとか)/全タンパク質量(チトクロムCの量+それ以外のタンパク質量)、これが純度です。
 しかし、ゲルの中のタンパク質の量を重さで求めるのは無理があるので、タンパク質量と染色の濃さ
は比例し、かつ全てのタンパク質で比例常数は同じと仮定します。つまり、どのタンパク質のバンドで
あっても、バンドの染色の濃さをそのタンパク質の量としてしまうと言う意味です。 従ってスキャンイングのパ
ターンが必要になります。そこから、足し算、割り算をしてください。

実習みたいな中身だけど、それなら担当教官に訊けば良いと思うが・・・?

>ブロモフェノールブルーの移動度を1とした各試料の相対移動度であるということですが、ブロモフェ
ノールブルーの移動度はどこからわかるのでしょうか。
意味がよくわかりませんが、ブロモフェノールブルーがどれだか解らないのですか?

>SDS-PAGEの結果のカラーコピーがあるのですが、これをものさしで測ってやればいいのでしょうか?
はい、そうです。普通はゲル上端からの距離を測ります。
ところで、バンドには太さがありま...続きを読む

Q分子量とマーカー移動度の片対数グラフでの調べ方

SDS-PAGEにおける分子量とマーカー移動度の片対数グラフでの調べ方についての質問です。

コラーゲンI型についてウエスタンブロットを行ったところ、予想以上にバンドが出てしまいました。そこで、分子量とマーカーの移動度から検量線を作ることになりました。

マーカーの移動度を定規で測り、エクセルにて縦軸を分子量(対数)、横軸を移動距離としてグラフを作りました。
その後、近似直線(曲線?、指数近似)とその数式を出してみると、
右肩下がりのy = 497.41e^(-0.0297x)という数式が出ました。

分子量が大きい物ほど移動度が小さいというのはわかるのですが、これであっているのかわかりません。

また、その数式から分子量(y)が分かっているときに移動距離(x)を求めたいのですが、
=log(497.41*2.71828,y)/(-0.0297)で計算すると移動度がマイナスになってしまいます。

どこで間違っているのかが分かりません。
どなたかご教授頂ければ幸いです。

Aベストアンサー

書かれている計算式がよくわからないのですが、なんかlogの展開がおかしいような・・?

よくわからないのでlogの展開の決まりを下に書いておきますのでご自分で検算してください。
Y=A*B/Cを両辺対数取ります。対数取ると、かけ算は足し算に、割り算は引き算にします。
logY=logA+logB-logCです。
それから、e^(-x)=1/e^(x)です。つまり497.41e^(-0.0297x)=497.41/e^(0.0297x)

Qカラムクロマトグラフィーの実験

カラムクロマトグラフィーの実験で光合成色素の分離をしたのですが結果から何がどの色素かはわかったのですが、どうしてそのような順番ででてくるのかが知りたいと思い構造を調べてみました。そかし化学の知識があまりないのでよくわかりませんでした。どなたか説明をしていただけませんか?ちなみにクロロフィルのaとb
の違いはCH3とCHOの違いのみで、β-カロチンとルティンはHとOHのみの違いでした。幼稚な質問とは思いますが、よろしくお願いします。

Aベストアンサー

 カラムクロマトグラフィーの原理的なことは教科書を御覧いただくか,トップページ(↓)で「クロマトグラフィー」で検索してヒットする関連質問の回答を御覧下さい。

 簡単に言えば,化合物の極性の違いに基づいて分離を行ないます。おそらく行なったのはシリカゲルを担体とする順相カラムクロマトグラフィーだと思います。この場合,担体のシリカゲルが展開溶媒よりも極性が高いですので,極性の高い化合物ほどシリカゲルにくっついて展開距離(Rf 値)が小さくなります。

 では,「クロロフィル a, b」,「β-カロチン」,「ルティン」で極性を比べてみましょう。化合物の極性を比べる方法ですが,簡単に言えば,ヘテロ原子(OやN等のC,H以外の原子)が多い程極性が高くなります。

 お書きの化合物の構造を見比べていただけば解ると思いますが,「β-カロチン」や「ルティン」に比べて「クロロフィル a, b」には多数の窒素原子が存在します。つまり,「クロロフィル a, b」の方が高極性です。

 「クロロフィル a」と「クロロフィル b」を比べると,お書きの様に「クロロフィル a」で CH3 の所が「クロロフィル b」で CHO と酸素が入っており「クロロフィル b」の方が高極性です。

 「β-カロチン」と「ルティン」の場合も,「β-カロチン」の H が「ルティン」では OH と酸素が入っており,「ルティン」の方が高極性です。

 つまり,極性は「β-カロチン < ルティン < クロロフィル a < クロロフィル b」の順になり,展開(溶出)はこの順で遅くなります。結果,カラムからは逆の「β-カロチン」→「ルティン」→「クロロフィル a」→「クロロフィル b」の順に出てくる事になります。

参考URL:http://www.okweb.ne.jp/index.php3

 カラムクロマトグラフィーの原理的なことは教科書を御覧いただくか,トップページ(↓)で「クロマトグラフィー」で検索してヒットする関連質問の回答を御覧下さい。

 簡単に言えば,化合物の極性の違いに基づいて分離を行ないます。おそらく行なったのはシリカゲルを担体とする順相カラムクロマトグラフィーだと思います。この場合,担体のシリカゲルが展開溶媒よりも極性が高いですので,極性の高い化合物ほどシリカゲルにくっついて展開距離(Rf 値)が小さくなります。

 では,「クロロフィル a, b」...続きを読む

Q電気泳動の原理について

今大学で電気泳動を盛んにしているのですが、いまさらながら電気泳動の原理や、なぜしているのかなどがいまいちよくわかりません・・・バンドがでてきますが、何を表しているのかもいまいちです。。情けない限りなのですが、どなたか教えていただけるとありがたいです。染色体地図をかいてくるとういう課題もでているのですが、電気泳動の意味がよくわかっていない自分には手のつけようのない課題なのです。どうかお願いします。

Aベストアンサー

DNAの電気泳動の目的は簡単に言うと、さまざまな大きさの断片をその大きさによって分離することです。
すなわち、泳動後に現れるバンドは、大きさのまとまった断片の集まりということになります。

まず、DNAは核酸という酸であるということはご存知のことと思います。
酸は水溶液中でマイナスに帯電します。
つまり、電気を流すとプラスの方へ流れていくことになります。
DNAを流すゲルは肉眼では見えないほど細かい網目構造となっているので、より小さな断片ほどその網目構造を素早く縫って移動できます。
これは、よりプラス極の近くに現れるバンドほど小さな断片であることを意味します。

以上のことをまとめるとどうでしょう?電気泳動の全体像が見えてきませんか?

Q酵素の比活性

 前にも似たような質問をしたのですが、よく分からないのでもう一度させていただきます。
 酵素の比活性でどのようなことが分かるのでしょうか?出来れば詳しくお願いします。

Aベストアンサー

比活性というのは、タンパク質あたりの活性と定義されます。
今、アルコールを酸化する酵素を測定するために肝臓をすりつぶしたとします。肝臓には数千種類のタンパク質がありますが、その中でアルコールを酸化する酵素はごく一部です。他のタンパク質は全然別の酵素活性を持っていたり、酵素ではないタンパク質だったりします。ですから、タンパク質あたりの活性を計算すると、分母が大きいから、比活性は小さい値がでます。ところが精製操作を行って、アルコールを酸化する酵素以外のタンパク質が取り除かれれば、分母は小さくなりますから、比活性は大きくなります。その大きくなり具合は、目的の酵素以外のタンパク質を取り除く操作、つまり精製操作の指標になります。完全に精製されれば、それ以上は精製しようとしても、比活性が高くならないはずです。誰かがある酵素をすでに結晶化して、そのような純粋な酵素の比活性を報告していれば、それとの比較で、自分の行っている精製操作がよいか悪いかがわかります。
とはいっても精製した酵素が一部失活すると、たとえば、半分が失活すると、タンパク質としては全部残っていますから元の値のままですが、活性は半分になったので、比活性は半分に低下します。つまり酵素の変性による失活の指標にもなります。

比活性というのは、タンパク質あたりの活性と定義されます。
今、アルコールを酸化する酵素を測定するために肝臓をすりつぶしたとします。肝臓には数千種類のタンパク質がありますが、その中でアルコールを酸化する酵素はごく一部です。他のタンパク質は全然別の酵素活性を持っていたり、酵素ではないタンパク質だったりします。ですから、タンパク質あたりの活性を計算すると、分母が大きいから、比活性は小さい値がでます。ところが精製操作を行って、アルコールを酸化する酵素以外のタンパク質が取り除かれれ...続きを読む

Q電気泳動写真からの濃度の求め方

DNA断片を1%アガロースゲルで泳動しました。EtBr染色し泳動写真からMarkerとの比較でDNA断片の大まかな濃度が求める方法を教えてください。Marker2を2マイクロリトッル使用。

Aベストアンサー

DNAに結合するEtBrの量は二本鎖DNAに比例するので
蛍光量はDNA量と比例します。

なのでサンプルと同じ濃さのMARKER2のバンドを探して、
そのバンドのDNA量を調べて求めます。
同じ濃さのものが無ければどのバンドと、どのバンドの間の濃さであるか見て概算します。

スキャナで取り込んでバンドの濃さを調べても出来ると思いますが、目で見て判断したほうが早いです。

マーカーのバンドの濃さの上限下限を超えている場合はDNAの濃さを概算することは難しいと思います。

Qサンプルバッファー

以前たんぱく質の実験をしたときに、SDS-PAGEを行う前にたんぱく質にサンプルバッファーを加えました。その後、サンプルバッファーで処理したたんぱく質を100℃で処理するのはなぜなのでしょうか?

Aベストアンサー

サンプルBufferには恐らく、色素(泳動のトレース用)、糖類(比重を上げるため)、還元剤(メルカプトエタノールかジチオスレイトールなど)、SDSが入っているはずです。

加熱することによりタンパク質を変性させて構造を壊してやり、SDSが全体に付着する、還元剤が全てのS-S結合に行き渡って還元が完全に行われるという効果があります。


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