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分子生物学を扱う研究室に配属された新4年生です。

先輩の研究を引き継ぐため、プラスミドベクターを分けてもらいました。

もらったプラスミドベクターの量が少ないため、増やそうと考えているのですが、具体的にどのような実験操作を行えば良いのでしょうか?

基本的な質問だと思うのですが、よろしくお願いします。

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A 回答 (2件)

コンピテントセルという大腸菌に遺伝子を組み込んで、プラスミドに挿入されている薬剤耐性に対する抗生物質を入れた培地で飼って、大腸菌を増やし、プラスミドを精製するだけです。


遺伝子組み込みの方法は大きく分けて、電気と温度の2通りがありますが、これによって使う大腸菌も違います。

この回答への補足

ありがとうございます!!

重ね重ね質問になるのですが…

この作業って形質転換でしょうか?
一晩培養した後は、どのようにして増やしたものをプレートから取り出すのでしょうか?
また、精製はボイルプレップをすればいいのでしょうか?

補足日時:2011/04/22 00:03
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この回答へのお礼

ありがとうございます!!

お礼日時:2011/04/26 19:58

指導の先生に伺うのが良いのではないでしょうか。

この回答への補足

書き込む前に、担当の教授に聞いたら「わかってるよね?」と軽くあしらわれてしまったため質問しました。
よろしくお願いします。

補足日時:2011/04/21 19:10
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Qプラスミドの大量調製

題字の如くなのですが、プラスミドの大量調製が思いのほかうまくいきません。培養の際の培地を500mlないし1lで大腸菌を増やしているのですが、大腸菌自体はばかばか増えるのに、そこから得られるプラスミドが10μgくらいしかありません。low-copy plasmidかとも疑い、培地の量をかえてトライもしてみましたが、こちらでもうまくいかないんです。
培地には抗生物質を添加しているので、プラスミドを持たない大腸菌が急増するということは考えにくいですし、やはり細胞内でのコピー数が少ないと考えています。
このようなプラスミドの収量を上げるには、どうすれば良いでしょうか?具体的な数字で表すと、100μgは取れるといいのですが。
何か工夫すべき点がありましたら、ご教授願います。

Aベストアンサー

まず、プラスミドの骨格は何でしょうか。
low-copyかどうかは普通は疑うのではなく調べるものです。
プラスミドのoriが何由来なのかを調べれば大体のコピー数と収量がわかります。
http://www.promega.co.jp/cat/technical/17-q.html
P1 phage由来のPACベクターに大きいインサートが入っていれば1l培養しても10ugしか取れないということはあります。

それと、1mlで培養した時にはどのくらい取れるのでしょうか。
たいてい少量のスケールで精製したもののほうがml当たりの収量はいいです。
大量培養した時にもそこから1mlとってちゃんと増えていることを確認したほうがいいかとおもいます。

実際の大量調整の時にはどの方法を使ってどのスケールでやっているのでしょうか。
アルカリSDS法かその変法のキットを使っていると思いますが、
ちゃんとリシスしているのか誰かわかる人に確認してもらったほうがいいと思います。
大腸菌が壊れていなければプラスミドは出てこないでペレットとして捨てられることになります。

抗生物質の濃度は適当なのでしょうか。場合によっては2倍くらいにしたほうが収量がよくなることがあります。

もしかりにlow-copyのプラスミドならば
途中でクロラムフェニコールを加えることにより大腸菌の増殖を止めてコピー数を増やすことができることがありますが、
コピー数が少ないプラスミドをわざわざ使っている時には、コピー数が増えると組換えを起こすようなインサートが入っていることがあるので
事前に調べておく必要があります。

まず、プラスミドの骨格は何でしょうか。
low-copyかどうかは普通は疑うのではなく調べるものです。
プラスミドのoriが何由来なのかを調べれば大体のコピー数と収量がわかります。
http://www.promega.co.jp/cat/technical/17-q.html
P1 phage由来のPACベクターに大きいインサートが入っていれば1l培養しても10ugしか取れないということはあります。

それと、1mlで培養した時にはどのくらい取れるのでしょうか。
たいてい少量のスケールで精製したもののほうがml当たりの収量はいいです。
大量培養した...続きを読む

Qベクターとプラスミドと形質転換

ベクターとプラスミドって何が違うんですか?
意味的にはほとんど同じだと思うんですが。

形質転換で大腸菌に入れて増やしますが形質転換の時に導入した物と同じものが得られるんですよね?

形質転換によってプラスミドはどれくらい増えるものなのですか?

Aベストアンサー

こんばんは。
もう答えは出ておりますので、補足を少しします。

プラスミドベクターはハイコピーの物とローコピーの物があります。
一つの細胞内(ここでは大腸菌一体の事をさします)。で増えるプラスミドの量はベクター内の複製起点及びそ周辺のDNAシークエンスによって異なります。

pUC、pBR系などの有名なハイコピーベクタープラスミドの複製起点はColE1をアレンジした配列が含まれており、一細胞内で500程度のコピー数になります。

それに反してpACYC系に見られるローコピーベクタープラスミドはp15の様な複製起点が厳密に定義されている物はコピー数が少ないです。
これによって一細胞内でのコピー数は20-30程度です。
この様に考えますとベクターコピー数も収量に大きく関与するファクターと言えます。

No.1さんは恐らくハイコピープラスミドベクターのオーバナイトカルチャーの事をご指摘されているのだと思います。

下らない補足、失礼致しました。

Q2つのシークエンスによる結果の違い

PCR後の精製産物をシークエンスするダイレクトシークエンスとクローニングしてプラスミド回収してからのシークエンスの2パターンで配列解析をしました。

するとダイレクトシークエンスはうまく読めたのですが、もう一方のシークエンスのほうは、配列を読めずNと表示されました。

一般的にダイレクトシークエンスは、うまく配列を読むことが困難だということを聞いたことがあります。

今回このような結果になったのは、たまたまなのでしょうか?

またダイレクトシークエンスの長所は、クローニングをしないので短期間でシークエンスが可能。短所は読めない配列が多いと聞いたことがあります。
そこでクローニング済みのシークエンスのほうの長短所って何なのでしょうか?

回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

こんにちは。

実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa(配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね)が5個なので、鋳型はA型が3に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、1:1ではなく、2:1とか4:1の定量性を見るのは難しいかと思います。

ダイレクトシーケンスは、増えたPCR産物をそのまま読むために、鋳型のある塩基が----taatGc----と----taatCc----が1:1で含まれているとき(ヒトゲノムでは父方と母方の塩基が違うことがよくあります)、次のようなメリットが考えられます。
・(メリット)そのシーケンスの波形はGとCが一対一で出てくるように定量性がややあること
・(メリット)シーケンシング反応はたまにエラーを起こしますが、それはマイノリティになります。正しい配列の波形の方が大きく出るので、鋳型の配列にほぼ一致した配列が読めます。

クローニング済みのシーケンスは、1クローンだけ読むと、その配列がシーケンシング反応によるエラーの塩基置換を含む危険性が高い一方で、
・一見、単一の産物に見えても1塩基レベル、あるいは全体にわたって複数の産物がPCRで増幅されたときに、複数のクローンをシーケンスすることでなにが増えたか調べられます。ダイレクトシーケンスではこれは難しいです。
・(先の方も書かれていますが)基本的には単一のプラスミドの配列を読むため、シーケンスがきれいに読めるはずですし、その後の応用(発現用のベクターに入れる)にはプラスミドでの塩基配列の正しさの確認が必要です。

クローニングしたプラスミドを読む場合はインサートの長さにもよりますが、最低3個くらい読んだ方が良いと思います。

プラスミドのシーケンスがうまくいかなかったとのことですが、制限酵素で確認されたのことでものは入っているのだと思います。シーケンシング反応はエタ沈がちょっとマズイだけでシーケンスが読めなくなったりするので、もう一回同じ事をやると読めるようになるかもしれません。
シーケンシングプライマーですが、プラスミドにあるシーケンシングプライマーの配列(T7, SP6, M13など)が実は、シーケンシング反応に有利な配列でないことがあります。最近は合成オリゴの値段も安いので、「同じ配列を複数読む」ようなことであれば、自分の入れたインサートにある配列でシーケンスされるのがよいと思います。「中から外に読む」感じです。もし、サイズが500bpとか小さいようならPCRで増やしたときに使ったfowardとreverseプライマーで網羅できるでしょう。
あと、ご存じと思いますが、シーケンス反応に持ち込むプラスミドとPCR産物の至適な量が違うので、そこの確認をされても良いかと。

また、制限酵素処理の代わりに、拾われたプラスミドを一度50uLのLBに移して、そのうちの1uLを鋳型にコロニーPCRなどでインサートの有無を確認して、インサートの入ったものだけを増やすとたくさんのコロニーをカルチャーしなくて済みます。

がんばってくださいね!

こんにちは。

実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa(配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね)が5個なので、鋳型はA型が3に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、1:1ではなく、2:1とか4:1の定量性を見...続きを読む

QpcDNAっていうベクターつかった事のある方。。。

分子生物初心者でよくわからないんですが・・・
pcDNA3っていう哺乳動物用のベクター、ご存知の方に質問したいのです。

pcDNA3に、発現させたい目的遺伝子を組み込んだ場合、N末ないしC末にtagって付加されますか?
ベクターの構造をみてもさっぱりで;特にtagに関する表記はされてないように思うのです。じゃぁ、発現させた後は、その目的タンパクの抗体で検出するしかないの?と感じています。
それとも、大腸菌用ベクターで予めtag付きで構築して、その付加されたtag部分もろとも切り取って、pcDNA3に組み込んで、tag付きタンパクとして発現させるんでしょうか??

ベクター構築初挑戦?者の質問ですので、表現が変だったらごめんなさい。

Aベストアンサー

目的タンパク質遺伝子のみではタグは付加されないはずです。

もし、タグを付けたい場合はおっしゃっているとおり
タグ付きの配列を入れる必要があります。

別に大腸菌のベクター由来じゃなくても入れることは可能です。ヒスタグの様に短ければプライマー内にヒスタグ配列をデザインすることで簡単に付加できます。それ以外でも制限酵素サイトと含めたプライマーでPCRすることでMCSに遺伝子を導入することが可能です。ただしフレームがずれないように注意する必要があります。

Qプライマーの希釈について

これからPCRを行う初心者です。
プライマーを合成してもらい、乾燥状態で届きました。
まずこのプライマーを100μMの濃度にするように言われました。添付文書に27nmolとあったので270μlの水で溶かせばいいのでしょうか?
PCRには0.2mMで使用したいのですが、100μMにした後、どのように希釈してよいのかわかりません。
計算がわからないので教えてください。
よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

>添付文書に27nmolとあったので270μlの水で溶かせばいいのでしょうか?

正解です。100 μMは100 pmol/μLです。27 nmol=27000 pmolなので、270 μLに溶かせばよいです。

>PCRには0.2mMで使用したいのですが、100μMにした後、どのように希釈してよいのかわかりません。

0.2mMは200 μMです。100 μMの濃度の倍ですから希釈ではできません。
なにより、0.2 mMは濃すぎます。勘違いでは?

プライマーは薄めすぎると分解しやすいので100 μMでストックするとして、当座使う分は10倍に薄めて10 μM (10 pmol/μL)にしておきます。これをPCR反応50 μLあたり1.0~2.5 μL(終濃度0.2~0.5 μM)使うくらいが相場だと思いますが。

Qグリセロールストックについて?

学生時代、大腸菌をグリセロールストックすると保存状態が良く長期間保存できる?という事をを教わったような記憶があります。なぜ普通に凍結するより状態が良いのでしょうか?理由とグリセロールストックの操作方法を教えて下さい。又、大腸菌以外の微生物にも有効なのでしょうか?教えて下さい。お願いします

Aベストアンサー

細菌類ならなんでもできると思います。
細菌を培養した液を保存用の小さいチューブに移し、グリセロールを加えて冷凍し(液体窒素やドライアイスなどで急速冷凍するのが望ましい)、マイナス80℃のフリーザーで保存します。半永久的に保存できます。グリセロール濃度はものの本や各メーカーから提供される形によって15-50%と幅がありますが、濃度が低めのほうが再融解しにくく持ちが良いように感じます。
使用するときは、凍結したまま少量を削り取って培地にまきます。

ちなみに、生物学研究で用いられるモデル生物のひとつ、線虫もグリセロールストックします。

Qクローニングとサブクローニング(長文になってしまいました)

植物を実験材料として扱っているのですが、植物からある特定の遺伝子を単離して、発現ベクターへ組み込む際、RT-PCR等でまずその特定の遺伝子を単離したとします。

この単離した遺伝子をまずpUC119等のベクターに組み込んでシークエンス解析を行い、配列が正しいか確認します。

シークエンス解析をし、あたりの配列をまた切り出して、発現ベクターへ組み込みます。

この作業において、僕は今までそれぞれここの作業はクローニング、実験系全体を見ると、pUC119に導入するのはサブクローニングで、発現ベクターに導入するのがクローニングだと思っていたのですが、どうも違うようなのです。

どなたかこの2つの言葉の違いをはっきりとした定義を教えていただけないでしょうか?(まわりくどい説明で申し訳ありません)

Aベストアンサー

遺伝子等の「クローニング」を小難しく言えば、ゲノムDNAやcDNAを増殖可能なベクター・宿主系に組込み、特定の配列を持つものを得るということになるでしょう。
サブクローニングもクローニングの内です。

サブクローニングとは、クローニングのなかでも特に、いったんクローニングした配列の中から、一部の断片(sub-fragment)を二次的にクローニングすることです。
たとえば、BACやファージをベクターとしたゲノムライブラリーから、目的の領域を含むものを単離した後、その中から必要な断片だけをプラスミドベクターにクローニングし直すときに「サブクローニング」と言います。

一方、ご質問の例のように、クローニングされている断片の全長を別のベクターに入れ直すのは、「リクローニング recloning」という語を使い、サブクローニングとは言わないと思います。

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Q菌液の均一な撒き方のコツを教えてください

コンラージ棒を用いて、形質転換した菌液を希釈別にLB固体培地に撒く作業が上手くできません。
先輩、先生に教えて頂いたやり方を実践していますが、菌が中央に寄ったり、ドーナツの様になったり、コンラージ棒の跡が残ったり、コロニーの大きさに差が在りすぎたりします。

塗り方:
1) まず中央に10μlの滅菌水をアプライし、コンラージ棒で適当に伸ばして固体培地の湿り具合を簡単に確認
2) 次に菌液を50μlアプライ→回転台を回しながら、コンラージ棒で縦の動きで伸ばす
3) 回転台を回しながら、固体培地の端にコンラージ棒を置き、かたむけながら徐々に中央に寄せる(端から中央にかけてまばらに菌を広げる)
4) 滑りが少し悪くなる迄2)~3)を繰り返す

主な原因として:
1) 菌液が濃すぎる
2) 塗り方に問題
3) コンタミが一部で起こっている
4) 菌のサンプルによって均一にならない(具体的な原因は解らないが)
等を考えています。

以上です。改善すべき点やその他の原因をお持ちでしたら、ご意見を頂けると嬉しいです。宜しくお願いします。

コンラージ棒を用いて、形質転換した菌液を希釈別にLB固体培地に撒く作業が上手くできません。
先輩、先生に教えて頂いたやり方を実践していますが、菌が中央に寄ったり、ドーナツの様になったり、コンラージ棒の跡が残ったり、コロニーの大きさに差が在りすぎたりします。

塗り方:
1) まず中央に10μlの滅菌水をアプライし、コンラージ棒で適当に伸ばして固体培地の湿り具合を簡単に確認
2) 次に菌液を50μlアプライ→回転台を回しながら、コンラージ棒で縦の動きで伸ばす
3) 回転台を回しながら、固体培地...続きを読む

Aベストアンサー

習うより慣れろの問題かもですが、
菌液のボリュームをもうちょっとおおくしてもいいかと思います。

100μlくらいでどうでしょう。

Qオートクレーブで水を滅菌したいのですが・・

オートクレーブで水を滅菌したいのですが・・

水をオートクレーブ(卓上の小さなもの)で滅菌することになったのですが
イマイチ心配なので教えて下さい。

水を三角フラスコに8割くらい入れ、口の部分をアルミ箔で覆い
ふつうにオートクレーブにかければ良いでしょうか。

水の量が多い?口の部分はアルミで良い?
・・など不安になってきました。
他に注意点などあれば宜しくお願いします!

Aベストアンサー

栓をする必要があります。

栓無しでも滅菌が出来ますが、
無菌室で無い場合は、オートクレーブから出したとたんに汚染される可能性があります。
三角フラスコの場合は、表示量より少し少ない目、ぐらいが適当です。
300mLなら250mLぐらいですか。

栓は、汚染を考えると密栓がいいですが、冷却を充分してから取り出さないと、
破裂する危険がありますので、蒸気だけ通じて、菌を通じないシリコ栓などを
使うと良いでしょう。


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