コンピテントセルを作るとき、みなさんどのような無菌操作をしていますか?
研究の関係で遺伝子操作もするようになったのですが(専門ではありません)、ガスバーナーによる簡易滅菌操作しか使っていません。
コンピテントセルは作成時に氷冷状態で操作するため、火のついたガスバーナーに近づける訳にもいかず、結局遠くで燃えている・・・という意味のない状態で作成しています。一応、コンピテントセル自体はうまく出来てるようなのですが・・・・

で、一般的には冷やした状態で、どう無菌操作をしてるのでしょうか?
ドラフトを使った方がいいのでしょうかね??

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A 回答 (1件)

お答えします。


いわゆる普通の実験、つまり、プラスミド導入のためのセル調製でしたら、特に厳密な無菌操作はしていません。滅菌したチューブやチップ、滅菌した試薬を使って一般実験室で行っています。後々、抗生物質を入れたプレートにまきますので、よっぽど汚いことをしない限りは大丈夫だと思うのですが。
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この回答へのお礼

なるほど!!やはりそうですか。ということは火も使ってないのですね?
埃が立たないよう掃除を徹底しなければ・・・・
回答ありがとうございました。

お礼日時:2001/04/29 16:46

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Qコンピテントセルについて

コンピテントセルの作製をしているのですが、各会社や注文した株によって大腸菌の種類って違いますよね?

例えばDH5α、JM109、HB101みたいに・・・

それぞれの菌株に適応した培地ってあるんでしょうか?

今は最も基本的なプロトコールに従って、LB培地で培養しています。

Aベストアンサー

菌株に特異的ではありませんが、
2xYT、3xLB、TB、MMI培地などを目的によって使い分けることは出来ます。

Qコンピテントセルの作製において・・

コンピテントセルを作る時、効率の良いものをつくるため(最低でもx10の7乗)懸濁する際やエッペンに分注する時には低温室で作業すると初めに習ったのでそうしているのですが、長時間4℃にいるのはかなりきついし精神的にもしんどいです。

できたら普通の部屋で氷上で冷やしながら作業したいのですが、低温室でやらなくても効率の良くなるコツとか分かる方いましたらご教授ください。

Aベストアンサー

私達の研究室でも塩化カルシウム法で作っていたのですが、効率が上がらなかったので塩化ルビジウム法という方法に代えました。私の場合、塩化カルシウム法に比べ、効率が100倍から1000倍くらいに上がりました。うちの研究室ではJM109の場合、誰がやっても10^7をきることはなくなりましたね。

参考URL:http://www.gene.mie-u.ac.jp/Protocol/Original/Transform-Comp-Cell-Freeze.html

Qコンピテントセル作製で

この時使用するTB bufferの中には、大抵塩化マンガンが含まれていますが、何故塩化マンガンが必要なのでしょうか?
通常、塩化カルシウム法を用いる場合、TB bufferを使用せず、塩化カルシウム溶液だけでもコンピテントセルの作製が可能とのことですので、塩化マンガンをわざわざ添加するということは、私なりに疑問に感じています。
どなたかご存じの方、よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

Hanahanを始め先人たちが、いかにすればプラスミド導入効率を高くできるか、いろいろ条件を検討した経験則としか言いようがないのではないでしょうか。そもそもMnに限らず、CaにしろRbにしろ、どのようなメカニズムで大腸菌にcompetenceを与えるのかも、はっきりとはわかっていないのですから(一説によると、大腸菌表面のリポポリサッカライドとDNAをくっつけるのに二価金属イオンが効いているのだとか)。
http://www.ias.ac.in/currsci/dec102002/1376.pdf

20年ほど前には、私もCaCl2だけで形質転換をしていました。確かにできます。でも、後々一般化した様々な改良法に比べると、形質転換効率やcompetenceの安定性、保存性は比べものにならないほど悪いですよ(たとえば、作ったcompetent cellはその日の内しか使い物にならない、凍結保存すると形質転換効率ゼロとか)。

Qコンピテントセルの作製について

学生です。

研究室でコンピテントセルを作製しているのですが、プレカルチャーの時点で培地がほとんど濁っておらず、吸光度を測定しても、ほぼ0です。

本来はプレカルチャーをしてから別の培地に希釈してカルチャーしますよね?この操作は重要でしょうか?

プレカルチャーであまりに育たないので、希釈をせずにそれをカルチャーとして気合で増やしましたが、タイターチェックすると全ての大腸菌がアンピシリンでセレクションがかかってしまいました。

プロトコルでは、プレカルチャーはLB培地で18℃、200rpmでovernight。
カルチャーはSOB培地で18℃、200rpmで約6hです。

培地、振とう回転数、温度で大きな差がでるのでしょうか?

同じような失敗をされている方、ほぼ確実にコンピが作れています!という方。お話を聞かせてください。

コンピは買うと高いのでお願いします。

Aベストアンサー

手順の説明としては、大腸菌の系統名とストックの状態(グリセロールストック? 何℃でどれくらいの期間保存?などなど)や植え方(ストックから直接?プレートにストリーキング?)などの情報があるといいですね。

>研究室でコンピテントセルを作製しているのですが、プレカルチャーの時点で培地がほとんど濁っておらず、吸光度を測定しても、ほぼ0です。

植えつけたタネはどういう状態のものですか? グリセロールストックやstab cultureだと保存中に死んでいることもあります。いったんプレート培地にstreakingして、生えたコロニーをタネにしましょう。
それでなくても、青白セレクションをする場合などはF’因子を保持した菌を選択して使う必要がありますので、M9最長培地プレートか、F'因子に薬剤耐性を持っている系統なら(たとえばXL1-Blueならテトラサイクリン)その薬剤入りのプレートで生えてきたコロニーを使うべきです。

>本来はプレカルチャーをしてから別の培地に希釈してカルチャーしますよね?この操作は重要でしょうか?

短時間(2-3時間)で最適な濃度まで増殖させるためとだと思います。
37℃で培養する従来の方法はオーバーナイトカルチャーを翌朝大きな培地に植えてODを測りながら培養し、適当な濃度になったら止めるというのが重要でした。

>プロトコルでは、プレカルチャーはLB培地で18℃、200rpmでovernight。
>カルチャーはSOB培地で18℃、200rpmで約6hです。

18℃で培養するのはInoueらの原法によるものでしょう。18度ならその時間スケールでは濁るほど殖えなくてもおかしくないです。

てもとに資料がないのでうろ覚えですが、彼らの方法では前培養なしで、いきなり本培養、ただしコロニーを複数ひろって菌数を多めに植えつけていたと思います。培養時間は2日くらいだったか。37℃で培養するのと違ってゆっくり殖ため、適当な濃度の範囲にある時間が長いので、つきっきりでODをモニターする必要がありません。

>プレカルチャーであまりに育たないので、希釈をせずにそれをカルチャーとして気合で増やしましたが、タイターチェックすると全ての大腸菌がアンピシリンでセレクションがかかってしまいました。

おそらく、植えたはずの大腸菌ではなく雑菌、真菌(酵母など)のコンタミが増えているのだと思います。

まとめると、
プレートにstreakingして生えてきて生きていると確認できた新鮮なコロニーを使う。培養時間はもっと長く見る。大腸菌の生育の至適温度ではないところで長時間培養するので、コンタミにはいつも以上に気をつけること(XL1など薬剤耐性をもつ系統なら薬剤入りで培養するのも手)。

手順の説明としては、大腸菌の系統名とストックの状態(グリセロールストック? 何℃でどれくらいの期間保存?などなど)や植え方(ストックから直接?プレートにストリーキング?)などの情報があるといいですね。

>研究室でコンピテントセルを作製しているのですが、プレカルチャーの時点で培地がほとんど濁っておらず、吸光度を測定しても、ほぼ0です。

植えつけたタネはどういう状態のものですか? グリセロールストックやstab cultureだと保存中に死んでいることもあります。いったんプレート培地に...続きを読む

Qコンピテントセル作成

コンピテントセルの作成においてCaCl2を用いたカルシウム法がありますが、CaCl2を用いる利点はなんですか?

Aベストアンサー

1、それなりの性能のコンピタントセルを作ることが出来る
2、商業的に購入可能
3、使用や排出にあまり規制を受けない

利点の比較対象は何ですか?


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