構造不明の遺伝子を解析する際にもPCRがよく用いられています。
 そこで質問ですが既にわかっている部分配列よりデザインした1つのプライマーでいきなりシークエンスして配列を読みそこからまたプライマーをデザインし、これを繰り返して構造解析はできないのでしょうか?簡単にできてしまうように思うのですが・・・・まだまだ無知なものでおそらく現在そのような解析方法を本で見たことがないので何か重大な欠陥があると思うのです。

A 回答 (1件)

(使われている単語から,taketaketakeoさんが基礎的な知識およ


 びシークエンシングの原理をご存知と思われるので,説明なし
 に専門用語を使用しました)

「いきなり」シークエンスするということは,ゲノムDNAをテンプレートにすることをさすのでしょうか?だとすれば,質問内容の方法での問題点はいくつかあります.1つはプライマーの非特異なアニーリングです.シークエンシング反応を行うとき,テンプレート(未知の遺伝子を含むDNA)中の複数カ所にプライマーが結合すれば同じ長さの異なる産物が生成されます.異種のシグナルが同時に生じるため,これをシークエンサーで解析してもピーク(もしくはバンド)が混在し正しい配列が読み取れません.かといって,「絶対特異的」プライマーのデザインは現実的ではありません.ですから,まず未知の遺伝子のcDNAをクローニングし,これをテンプレートとしてDNA配列を調べる手順をとったほうが正確で速いと思います.
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この回答へのお礼

 非特異なアニーリングとは気づきませんでした。なるほどそうなるとシークエンスの結果がめちゃくちゃになりますね。ありがとうございました。すっきりしました。

お礼日時:2001/05/23 01:10

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参考URL:http://www.chem-station.com/yukitopics/dna.htm

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ただし、各々の塩基がどちらのallele由来か判定することはできません。

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googleのimage(イメージ)で検索してみると

Double helixで検索結果
http://images.google.co.jp/images?q=Double%20helix&hl=en&lr=&c2coff=1&safe=off&sa=N&tab=wi

spiralで検索結果
http://images.google.co.jp/images?q=spiral&hl=en&lr=&c2coff=1&safe=off&sa=N&tab=wi

でした。

Qシークエンスでプライマー配列部分の塩基は決定可能?

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実は、最近読んだ国際誌(Molecular Ecology)の論文で、(そのPCRに利用したと明記されている)プライマーがアニールするはずの部分の塩基を決定し、そこにたくさんの多型(全多型の約20%)を検出しているのをみて不思議に思った次第です(GenBankにも同様の配列が登録されていました)。
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メジャーどころの国際誌に出ているのだから問題ないと思わないでもないのですが、配列のローデータにまであたらないと分からないわけですから、見落されていたということもありえると思うのです。
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どうぞよろしくお願いします。

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これに気付け!
f(k)=Bk^2-Ck-Ak^α=k^α(Bk^(2-α)-Ck^(1-α)-A)について考える。ただし、k>C/Bとする。
f(k)=0ということはk^α=0になるかBk^(2-α)-Ck^(1-α)-A=0になるかいずれかである。
(1)k^α=0のとき、これはC/B<0かつ0<α<1のときでしかk^α=0なるkの存在性は成り立たない。(各自なぜそうなるか確かめよ)
(2)Bk^(2-α)-Ck^(1-α)-A=0の場合を考える。
ここでg(k)=Bk^(2-α)-Ck^(1-α)-AとおくとC/B≧0ならばAB>0でなければいけない。逆にC/B<0ならば
g'(k)=k^(-α){B(2-α)k-C}でk=c/B(2-α)のときはg'(k)=0でg(k)は極値を持っている。(本当は
厳密に示さんといけないが、ここでは省略。)
そしてB>0のときg(c/B(2-α))<0でB<0のときg(c/B(2-α))>0
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よって(1)(2)合わせるとC/B≧0かつAB>0・・・・答え の場合と
C/B<0かつB×g(c/B(2-α))<0またはC/B<0かつ0<α<1・・・答え である

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(1)k^α=0のとき、これはC/B<0かつ0<α<1のときでしかk^α=0なるkの存在性は成り立たない。(各自なぜそうなるか確かめよ)
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Qダイデオキシ法におけるプライマー配列について

ダイデオキシ法におけるプライマー配列の設計は、フォアードプライマーは、目的の配列の3'→5'の前方に結合するように、リバースは相補鎖の5'→3'の向きで結合するように設計しますが、疑問があります。

(1)ダイデオキシ法は、普通のPCR(設計したプライマーで、はさまれた間が増幅される)と異なり、元のDNA鎖に何度もプライマーが結合し、その後にddNTPが結合して順番に塩基が読めるものと理解していて、出来上がった遺伝子断片に再び、プライマーが結合することはなく、もとのDNA鎖のみに何度も結合していくのですよね?この理解は正しいのでしょうか?

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(3)伸長反応は酵素にもよりますが、全長は伸びず途中までしか読めないことから、シークエンス解析では、フォワードとリバースをプライマーに用意しますが、疑問があります。リバースを用いて読めた配列を反転し、フォワードを用いて読めた配列と結合するのは、機械が自動的にしてくれるのでしょうか?

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ダイデオキシ法におけるプライマー配列の設計は、フォアードプライマーは、目的の配列の3'→5'の前方に結合するように、リバースは相補鎖の5'→3'の向きで結合するように設計しますが、疑問があります。

(1)ダイデオキシ法は、普通のPCR(設計したプライマーで、はさまれた間が増幅される)と異なり、元のDNA鎖に何度もプライマーが結合し、その後にddNTPが結合して順番に塩基が読めるものと理解していて、出来上がった遺伝子断片に再び、プライマーが結合することはなく、もとのDNA鎖のみに何度も結合していくの...続きを読む

Aベストアンサー

1;あっています。アニーリング(鋳型にプライマーがくっつく)>伸長>熱変性。を繰り返すだけです。増幅断片はその後の増幅されませんし、増幅に利用もされません。

2;読めません。相補鎖的な配列にくっつくためのプライマーを添加しないので、増幅しないためです。ですので、質問にありますが、プライマーがなくてはdNTPは結合しません。〈あとddNTPは終末端です。伸長するときに結合するのはdNTP)
設計したフォワードがはいってたというのはよくわかりませんね。クローニングとかしてませんよね? シーケンスに使ったプライマーが読めてるのはおかしいです。理論的にはありえません。プライマー配列のタンデムリピートとか、実験ミスとかを再確認してください。

3:これは機械によります。でも普通はしてくれません。自分でアライメントしてください。あと長塩基を解析できない理由は、全長は伸びず・・・というよりは100と101は区別できても10000と10001の区別は難しいから・・・という電気泳動的な問題です。

Qa,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1

a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を
満たすs,tが存在するとき、x^2-(a+d)x+(ad-bc)=0
の解は、2つの異なる実数解で-1<x<1に存在することを示せ。

つぎの流れで考えました。
f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)
この(1)(2)(3)を示せればよい。
s(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0これと同値は両辺を足したものと掛けたものがどちらも正であるから、
s(1-a-c)+t(1-b-d)>0・・・(4),-s^2c(1-a)+st{(1-a)(1-d)+bc}-t^2b(1-d)>0・・・(5)
これを満たすs,t が存在するということをどう(4)(5)に反映させるかが分からなく、ここで行き詰まりました。このあとどうすればいいのか、よろしくお願いします。

a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を
満たすs,tが存在するとき、x^2-(a+d)x+(ad-bc)=0
の解は、2つの異なる実数解で-1<x<1に存在することを示せ。

つぎの流れで考えました。
f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)
この(1)(2)(3)を示せればよい。
s(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0これと同値は両辺を足したものと掛けたものが...続きを読む

Aベストアンサー

 質問者さんの方法に沿って考えてみると次のようになります。

>f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
>x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
> 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)

  ここはいただけません。
  この(1)~(3)は「a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を満たすs,tが存在する」ことを使わずに何を証明すれば良いのかを示しているだけですので、「(a+d)/2>0」は使わずに次のようにした方が良いです。
  f(±1)>0 ⇔ 1干(a+d)+ad-bc>0 ⇔ (1干a)(1干d)-bc>0 (複号号順) ・・・(3’)


>この(1)(2)(3)を示せればよい。
  ここまではOKです。


>s(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0これと同値は両辺を足したものと掛けたものがどちらも正であるから、
>s(1-a-c)+t(1-b-d)>0・・・(4),-s^2c(1-a)+st{(1-a)(1-d)+bc}-t^2b(1-d)>0・・・(5)

 ここは次のようにすると良いと思います。
  s(1-a)-tb>0 ・・・(A)
  -sc+t(1-d)>0・・・(B)
 
 とりあえず式(A)(B)を変形して次の関係を得ます。(質問者さんは既に分かっているようですが、次の展開のためにここで言っておきます。)
  s(1-a)>tb ∴0<a<1  ・・・(C)
  t(1-d)>sc ∴0<d<1  ・・・(D)

 式(A)×c+式(B)×(1-a)としても不等式の向きは変わらないので次の関係が成り立ちます。
  t{(1-a)(1-d)-bc}>0
 ∴(1-a)(1-d)-bc>0   ・・・(E)
 また(C)(D)(E)から次の関係も成り立ちます。
  1+(a+d)+ad-bc>0
 ∴(1+a)(1+d)-bc>0  ・・・(F)

 ここまでのことから(C)(D)は条件(1)を示し、(E)(f)は条件(3)を示しているので、後は条件(2)だけを示せば良い。
 ところで条件(2)の右辺は
  (a+d)^2-4(ad-bc)=(a-d)^2+bc>0
と変形できて条件(2)を満足させることが示される。

 従って、以上のことから 与えられた2次方程式の解は2つの異なる実数解で-1<x<1に心材することが示された。



 あとはこのままの証明では行ったり来たりで煩雑になりますので、順番を前後逆にして記述すると良いと思います。

 質問者さんの方法に沿って考えてみると次のようになります。

>f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
>x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
> 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)

  ここはいただけません。
  この(1)~(3)は「a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を満たすs,tが存在する」ことを使わずに何を証明すれば良いのかを示しているだけですので、「(a+d)/2>0」は使わずに次...続きを読む

QPCRプライマーへの制限酵素配列付加

こんにちは。いつもお世話になっています。

プライマー設計についてなのですが、
“制限酵素配列を付け加える場合は余分に数塩基追加した方が、制限酵素による切断効率が低下しない。”
というのを聞いたのですが、実際に全く余分な配列を付加しなかった場合とではどれくらい差があるのでしょうか。
もしくは、全く付加しなかったプライマーでのPCR productを制限酵素処理し、ベクターに導入した際の効率はかなり下がってしまうのでしょうか。

・・・というのも、大変お恥ずかしい話、今回PCR productをベクターに挿入する目的で制限酵素配列を付けたプライマーを設計したのですが、上記定義をプライマー作成後に聞き、もう一度作り直した方がいいのか悩んでおります。
基本中の基本のミスなのは重々承知の事なのですが、どなたかご存じの方がおられましたら、些細な事でも構いませんので教えて下さい。宜しくお願い致します。

Aベストアンサー

No. 2補足です

プライマーを注文しなおすのが心苦しいので、いまあるやつで何とかしたいというなら、

1. 二度手間ですが、PCR産物をTAクローニングか平滑末端クローニングして、プラスミドから目的の酵素で切り出す。

2. PCR産物をpoly nucleotide kineseとATPで末端リン酸化、ligationして重合させてから、目的の酵素で切る(これによって、ポリクローニングサイトの隣接するサイトを切るのと同等になる)。ただし、一方の切断によって切れ端が他方の末端についた場合でも必要な塩基数がまかなえない場合、効率が悪くなるとか、消化の順番が重要になるかもしれません。


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