閲覧ありがとうございます。
数週間前にバイオ系の研究室に配属されました、大学3回生の者です。
 

癌細胞(浮遊、接着)を細胞培養専用のフラスコを使って培養しています。
細胞が増えたらチューブに移して遠心にかけ、上清を吸って培養液を入れ数個のフラスコに分けるのですが、
その分けた後のフラスコを見ても細胞が全くない、あるいは非常に少なくそれからは育たずに消えて(死んで?)しまいます。


遠心後の時点でチューブの底にペレットはあるので、おそらくその後の操作が悪いのだと思います。
オートピペッターを使ったピペッティングが上手く出来ていないからと思いましたが、移した後でチューブを見てもペレットは残っていないようです。ピペッティングの際は、培養液をチューブに入れるときに少し入れた後、数回液を吸ったり出したりしてから全て出しています。

それなら上清を吸うときにペレットも吸ったのかなとも思いましたが、もちろんパスツールをチューブの底まで突っ込むような事はしていません。チューブを傾けて、パスツールを壁に当てるようにして吸っています。


おそらくこのどちらかが原因だと思うのですが・・・
自分なりに慎重に操作しているつもりですが、どこが悪いのかわかりません。


熟練した方に見て頂けたら一番良いのですが、先輩や先生は自分の研究で忙しそうなので頼みにくいです…
細胞を使わずクリーンベンチ内で練習した時は見て下さいましたが、特に悪かった訳ではなさそうでした。


研究室での課題が進められず、本当に困っています。
全くの初心者なので、用語が間違っていたり言葉足らずでしたらごめんなさい。


細胞を使った研究などをされている方から何かアドバイスを頂ければと思い、質問させて頂きました。
よろしくお願いします。

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A 回答 (5件)

No.1です。

やっぱり吸っちゃってましたか(汗

・遠心終了後、時間が経つとペレットが緩んでしまいます。遠心後はできるだけ速やかに上清を除去すると良いですよ。

・遠心管を遠心機から取り出す際や運ぶ際など、ペレットが乱れないように優しく扱ってみて下さい。

・先輩に聞かずに失敗するよりは、聞いた方が絶対良いです!変に遠慮するとお互い損です。
 また聞くだけでなく、操作を見せてもらうのもいいと思いますよ^-^

頑張って下さい!
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この回答へのお礼

初めに的確なアドバイスをしてくださったw6o6nさんをベストアンサーに選ばせて頂きます。
あれから自分のどこが悪かったかを見直し、ようやく成功しました。
まだまだ不慣れですが、これからも与えられた課題を頑張ってこなそうと思います。


お時間を割いて回答して下さった皆様、本当にありがとうございました。
今後の参考にさせて頂こうと思います。

お礼日時:2012/11/03 17:02

トリプシンの処理が長すぎたりピペットで激しく若しくは長時間混ぜすぎて細胞が死んでしまっているのかもしれませんね。



「あるいは非常に少なくそれからは育たずに消えて(死んで?)しまいます。」
よく分かりませんが、接着系だったら少しでも細胞があるようでしたら諦めずにずっと飼ってみたらどうですか?多分増えてくると思うのですが。

「熟練した方に見て頂けたら一番良いのですが、先輩や先生は自分の研究で忙しそうなので頼みにくいです…」
気持ちは分かりますが、一度くらいは観てもらいましょう。

単に、細胞を維持していきたいだけなのですよね?
だったら、例えば接着系の細胞の場合、10cmディシュだったらトリプシン-EDTA液を1mL入れてインキュベーターに1,2分入れておいてから培養液を5-10mL加えてピペットで懸濁して、10mLの新しい培養液を加えた新しい培地にその細胞の液を1,2mL加えれば問題ないし(トリプシンは希釈されるし培地には高蛋白質のFBSが入っているはずなのでトリプシンは不活化されます)、浮遊系の細胞なら増えた細胞の培地から1mL取って10-20mLの新しい培地に加えて培養すれば問題ないです。

ただ、先輩や先生はこういったやり方を嫌がるかもしれません。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございました。
処理にトリプシンは使っていませんが、ピペッティングのし過ぎは考えられるかもしれません。

培養液の一部をとって新しい培地に移すやり方は、私の研究室では誰もしていないそうです…

お礼日時:2012/11/03 17:06

ペレットを吸うというのは考えにくいですね。


心配なら適当なビーカーにデカンタで上清を捨ててみたらいかがでしょうか。
ただの継代なら上清をギリギリまで吸う必要はないですよ。

あと考えられるのは
接着細胞であればトリプシン処理のし過ぎで細胞が死滅
遠心分離の回転数が高すぎて細胞が死滅
くらいでしょうか。

なんにせよ、慣れないうちは継代後もサンプリングをして
トリパンブルー処理後、細胞数を測定した方が良いですよ。
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この回答へのお礼

遠心分離の回転数や、接着細胞の処理(EDTAのみです)は同じ細胞なら全員共通なのでおそらく問題ないと思います。
今まで上清をかなりギリギリまで吸っていましたが、少し余裕を持っても大丈夫なのですね。
細胞数のカウントは、課題に含まれているのでいずれやります。

回答ありがとうございました。参考にさせて頂きます。

お礼日時:2012/10/29 22:26

細胞の濃度(密度)が低いと、生育に支障がでることがあるので、まず、あまり薄めないようにします。



培地、まちがっていませんよね。また遠心で死ぬ可能性があるので、遠心しないで、単に、1枚のシャーレから2枚に分けるとか。古い培養じょうせいをわざと、持ち込むようにします。私はフラスコより10cmなどのシャーレが好きですね。私は、増やすとき遠心しませんけど。
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この回答へのお礼

まだ操作に不慣れの為、細胞濃度は少し濃くなるようにしています。
培地は全員共通です。(名前ははっきり覚えていません、すみません。)
遠心はしないに越したことは無い気がします・・・

回答ありがとうございました。

お礼日時:2012/10/29 22:35

上清を吸うときにペレットも吸っている可能性が非常に高いです。



吸引力が強いと、多少ペレットから離れていてもズルっと吸ってしまいます。
ペレットの近くまで上清を吸ったら、パスツールピペットを上清に差し込んで吸わず、液表面から少しずつ吸うのがコツです。
吸引時にペレットを凝視し、最後までペレットが吸い込まれていないことを確認して下さい。

念のため、遠心機の設定を確認してみて下さい(低速遠心で落ちるのでまず大丈夫と思いますが)。

この回答への補足

回答ありがとうございました。

どうやら、ペレットも吸っていた事が一番考えられる原因の様です。
今日パスする際に、接着細胞と浮遊細胞を同時に遠心しましたが、遠心後クリーンベンチに戻す際に底のペレットが浮いてしまいました。
接着の方はペレットがはっきりと確認できたため、(今のところ)成功しましたが
浮遊の方はおそらく吸ってしまったようで失敗しました。

遠心後ペレットを浮かないようにするには、やはり慎重に動かすしかありませんか?
浮いてしまっても、もう一度遠心するわけにはいかないので・・・

補足日時:2012/10/29 22:44
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では初代培養細胞の利点は何かあるのでしょうか?

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これをまずは見てみて下さい。
http://oshiete1.goo.ne.jp/qa4078187.html

>実験を行う上での選択の基準は何でしょうか?

自分の実験で扱いやすいと思った方を使うだけです。
この二つの細胞は、遺伝子導入が容易いので、よく使いますが、
どっちが良いのかというのは個人の判断です。

>HeLaは癌細胞由来だから癌細胞のアッセイなどに使って、HEKは正常細胞を見たいときにつかうということでしょうか?

いいえ。どちらも既に正常細胞ではありません。正常細胞はあくまで初代培養細胞です。この二つはどちらもずーっと分裂し続けます。

>あと初代培養細胞株と通常の細胞株の違いって、初代培養細胞株は培養条件や形質転換の条件が確立されていない点で扱いにくいという理解でよろしいのでしょうか?

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これをまずは見てみて下さい。
http://oshiete1.goo.ne.jp/qa4078187.html

>実験を行う上での選択の基準は何でしょうか?

自分の実験で扱いやすいと思った方を使うだけです。
この二つの細胞は、遺伝子導入が容易いので、よく使いますが、
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単細胞の細胞膜(外)は結局プラスもしくはマイナスのどちらに帯電しているのでしょうか?

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Aベストアンサー

>細胞膜にはイオンチャネルがありNa、Kイオンなどのプラスイオンが細胞内外に細胞膜を介して出入りするとありますが、どちらもプラスイオンなので細胞膜外はプラスに帯電しているように感じます。

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ナトリウムとカリウムのイオンはその比が重要なのであって、極端に濃度が大きかったり、小さかったりしなければ、帯電とは関係ありません。

[Na^+]/[K^+]比が生物の情報伝達の正体です。

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 宜しくお願い致します。

Aベストアンサー

2での質問もしているようですので合わせて回答します。

1.基本的には、培養でしばらくたった後の不要な不純物や弱って接着しなくて死んでしまった細胞を取り除くことと、血清中に含まれるトリプシンを失活させる成分を除去することが目的かと思います。強くやりすぎると(特にはがれやすい細胞は)多少なりダメージになりますし、PBSで長時間インキュベートするだけでもある程度細胞ははがれます。というわけで、さっと2回ぐらいやればいいと思います。はがれやすかったり、目的によっては1一回そっとやる程度とかでもいいでしょう。

2トリプシンEDTAは細胞に少なからず毒性があるのでできるだけ少量で少し浸るぐらいでいいでしょう。ただ、これも細胞によってははがれにくい場合や、少量から増やしてきたりしてしばらく継代をしていない細胞の場合は、少し多めでもいいと思います。軽くゆすって全体をなじませてやったほうがいいですが、あまり激しく叩くのは良くないのでは?インキュベーターに入れたほうがトリプシン(酵素活性)がより働きますが、経験上入れなくても多くの細胞で結構はがれてきます。はがれやすいもので1,2分~はがれにくいもので5分ぐらいが目安ではないかと思います。 いずれにせよ、後できちんと適量のメディウムをいれてトリプシンを失活させてやることが重要かと思います。

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この辺のやり方は研究室の技法によって多少違うので、基本(細胞毒性とか、酵素をだめにしないとか)を守ればそこまでシビアにならなくてもよいと思います。あまり神経質になると、時間ばかりかかって実験時間がもったいないので。。。

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1.基本的には、培養でしばらくたった後の不要な不純物や弱って接着しなくて死んでしまった細胞を取り除くことと、血清中に含まれるトリプシンを失活させる成分を除去することが目的かと思います。強くやりすぎると(特にはがれやすい細胞は)多少なりダメージになりますし、PBSで長時間インキュベートするだけでもある程度細胞ははがれます。というわけで、さっと2回ぐらいやればいいと思います。はがれやすかったり、目的によっては1一回そっとやる程度と...続きを読む

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細胞分画法を用いて細胞小器官の分画を行っています。
オルガネラ画分に核膜が混入していないことを証明するためのマーカーを探すように上から言われたのですが、GoogleとかMedilineあたりではヒットしてきません。
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ご存知の方がいらっしゃいましたらご教授願います。
もし分かれば、参考文献も教えて頂ければと思います。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

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Q培養細胞を免疫染色した後の封入剤

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封入剤はcrystal mountというコスモバイオから出ている水系封入剤で、カバーガラスなしで乾かして固化します。
説明書を読むとfor immnohistchemistry、どうも切片標本用の封入剤みたいです。
この感じだと、その封入剤が適していないことは明らかな気もしますが、このような場合、どういう封入剤が適しているのか。そして「こういう場合にはこういう封入剤を使え」というルールがあれば教えて頂きたいです。

初心者な質問で申し訳ありません。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

>どうも切片標本用の封入剤みたいです。
そこが問題なのではないです。カバーガラスをかけて封入出来る程度の厚みものなら、基本的に使えるはずです。問題は、crystal mountが(非水溶性の)色素系染色(DAB, NBT/BCIPなど)に使われるもので、蛍光染色用ではないことです。説明書にどのような染色に適するかは明記してありますよね。

蛍光観察をする場合の封入剤は、
・励起光、蛍光を吸収しないこと(弱めないこと)
・自身が蛍光を発しないこと
が不可欠です。

もっともよく使われるのはグリセロールです。このての目的のために「非蛍光」品質を保証している製品もあります。
他にも各社からいろいろな製品が出ているとは思いますが、よく使われるのは、Vector社のVectashieldでしょうか。
どちらにしても、カバーグラスをかける必要があり、固化しませんので保存する場合は、マニキュアなどで周りを封じて水平に保つ必要があります(固化するタイプで蛍光観察に耐える封入剤は、私の知る限りないです)。

>どういう封入剤が適しているのか。そして「こういう場合にはこういう封入剤を使え」というルールがあれば教えて頂きたいです。

説明書を読めば、どんな染色に適しているかは書いてあるはずで、あとは
用途に応じたものを選べばいいだけです。蛍光観察向きと明記していないものは蛍光染色に使うべきではありません。

おおざっぱに言うと、
蛍光観察する場合の封入剤は上に書いたとおり。
色素型では、色素が水溶性なら有機溶剤系の封入剤を使う必要があり、有機溶媒に溶ける色素の場合は、水系の封入剤を選ぶ必要があります(色素が溶けてにじむので)。

>どうも切片標本用の封入剤みたいです。
そこが問題なのではないです。カバーガラスをかけて封入出来る程度の厚みものなら、基本的に使えるはずです。問題は、crystal mountが(非水溶性の)色素系染色(DAB, NBT/BCIPなど)に使われるもので、蛍光染色用ではないことです。説明書にどのような染色に適するかは明記してありますよね。

蛍光観察をする場合の封入剤は、
・励起光、蛍光を吸収しないこと(弱めないこと)
・自身が蛍光を発しないこと
が不可欠です。

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