現在読んでいる文献の中に、”相補的DNAを導入し過剰発現を行った”との記述があったのですが、どのような原理なのでしょうか?
使用している細胞はCOS細胞で、発現したタンパクはシャペロンの一つBiPのwild typeです。
よろしくお願いします。

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A 回答 (3件)

rei00さんの言う通り、この機会に分子生物学の基礎から本を読み直すことが、一番のいい理解方法ですが、一応、そのpaperの指摘されている記述(それだけの表現で的確に説明できているかどうか不安ですが)について、簡単に説明します。

(基礎的なことなので、そんなの知ってるのに!!と思われるかも知れませんが…)
蛋白の合成は、まず、targetの蛋白の情報を持つDNA(情報鎖)に対して相補的な配列を持つ側のDNA鎖(鋳型DNA)からDNAの情報がmRNAに転写されます。この情報鎖DNAとmRNAの蛋白質コード部分は塩基の中でチミンとウラシルの違いがありますが、(原理的には)同じ塩基配列を持つことになります。
そのmRNAがリボゾーム上に結合し、そこで翻訳され、対応するアミノ酸がアミノ末端からカルボキシル末端に向かう方向で次々と結合していき、翻訳が終了すると、リボゾームから切り離されて、蛋白の合成が終了します。
しかし、いくらtargetの蛋白のDNAを宿主細胞に導入しても、細胞内のDNAaseで分解されたり、増殖が不十分で希釈されてしまって、意味をなさなくなってしまいます。
そこで、問題の相補的DNA(cDNA)ですが、これは通常バクテリアをベクターとして用いて蛋白の発現を行うときに用いられます。真核生物のDNAにはmRNAに転写されないintronという余計な塩基配列(介在配列)があり、mRNA転写時にはこの部分が取り除かれて翻訳に必要な塩基配列(exon)だけになります(この現象をRNAスプライシングと言います)。このintronを含むDNA断片を組み込んだベクターを原核生物である宿主のバクテリアに導入しても、バクテリアにはスプライシング機構は持っていないので、蛋白の発現ができません。そこで、targetの蛋白のmRNAを上手く細胞から単離して、これに逆転写酵素を働かせることによりmRNAとそっくりなcDNAを調製し、これを宿主ベクター系に導入することにより、蛋白を発現させます。現在はDNAシンセサイザーにより、人工的にcDNAを合成することも可能です。
しかし、ただ単に情報鎖のみのcDNAを導入しても蛋白発現は上手くいきません。このために、蛋白の発現を調節する調節領域(プロモーター)を目的遺伝子のすぐ上流にセットして、宿主ベクターのRNAポリメラーゼにより上手く認識され転写が進むようにする必要性があります。バクテリアの場合はもちろん、SD配列(Shine-Dalgarno配列)を直前に入れておく必要もあります。これらの調節領域は宿主に適したものを選ぶ必要があり、cDNAに組み込む手間はありますが、人工的にcDNAを合成するのであれば、はじめからこの部分を含んだ塩基配列通りに合成することができます。
質問中にあった「過剰発現を行う」のであれば、おそらくその目的に応じた調節領域を組み込んだcDNAを導入したのでしょう。
さっと流した文章の中に、「ベクター」と「宿主」という言葉がありますが、蛋白の発現を行う場合、自己増殖機能を持った環状の小さなDNA分子を持つプラスミドに調節領域等を入れた目的DNAを組み込み(プラスミドベクター)、これをバクテリアに導入することにより、バクテリア内で蛋白が発現されます。
今回の場合は、COS細胞において蛋白の発現を行っているようですので、その細胞に応じたベクターに、その細胞に応じた調節領域を入れたcDNAを組み込んで、それをCOS細胞内に導入して、蛋白の過剰発現を誘導したのでしょう。
私も実際に行っているわけではなく、文献や教科書等で得た知識しかないので、求められている答えが導き出せているか、何とも心許なく思っておりますが、COS細胞における詳細な蛋白発現法については、秀潤社の「細胞工学」別冊のバイオ実験イラストレイティッド等の本を読まれると最も良いでしょう。(下記URL参照)「蛋白質 核酸 酵素」にも、紹介があるかも知れません。
頑張って研究してください。

参考URL:http://www.shujunsha.co.jp/saihome.html

この回答への補足

わかりやすいご説明ありがとうございます。
すみません。質問の説明が足りなかったようです。
この文献では他のタンパクの発現も行っているのですが、それぞれにベクターやプロモーターの解説があり、ご説明頂いたような手順で導入しエレクトロポレーションしているようなのですが、過剰発現の系に関してだけはcDNAをマイクロインジェクトしたとの記述しかありませんでした。
そこで、cDNAが1本鎖であるがゆえの何か特異的な反応があり、勝手に過剰発現してしまうのかと思ったわけです。
参考書等を探してもcDNAを直接導入しての過剰発現と言う記述は見つける事ができませんでした。
ネット上では、cDNAを使用して過剰発現を行ったとの記述はよく見るのですが、詳しい原理については見つける事が出来ませんでした。
ただ、検索エンジンですぐに引っかかるので、メジャーな手法なのかと思い、専門の方ならcDNAと過剰発現がすぐに結びつくのかと思い、あのような質問の形式にしてしまいました。
説明不足を重ねてお詫びします。
私の研究内容とは直接関係ないのですが、訳あって後輩に専門外の文献を指導しなければならない立場にあります。
というわけで、この質問をもう少し継続したいのですが、アドバイスよろしくお願いします。

補足日時:2001/05/31 15:46
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相補的DNAとはcDNAと表記されていませんでしたか?


もしそうであるならば、これはmRNAに対する相補的DNAのことです。
すなわち、BiPをコードするmRNAをとってきて、これに対する相補的DNAを
逆転写反応で作製し、DNAの形にしてから、ベクターにつなぎ、細胞に導入します
すると目的のタンパクがそこから発現するということになります。

過剰発現は、プロモーターを強いものにして通常より多く発現させることで、
目的タンパクの機能を明確に示すために行われます。
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文献を読んでられるという事はある程度きちんとした知識が必要だと思います。



それでしたら,図書館に行って「細胞生物学」,「分子生物学」,「遺伝子工学」,「生化学」等の教科書を探して見て下さい。

かならず記述があると思います。こうやって,知識を増やしていって一人前の研究者(専門家)になっていくのですよ。

あ,その際に細胞の違いとかタンパク質の違いは気にしないで下さい。原理は同じですから。
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g'(k)=k^(-α){B(2-α)k-C}でk=c/B(2-α)のときはg'(k)=0でg(k)は極値を...続きを読む

QDNAクローンと過剰発現について

すみません。初歩的な質問ですが、混乱しています。

特定のヒト遺伝子をE.coliに発現させる場合、
DNAフラグメントをプラズミドに挿入してトランスフェクションするは分かるのですが、挿入するDNAフラグメントはある程度特定できるものなのでしょうか?全てのフラグメントとなると膨大な数になってしまいますが、かといって特定方法がわかりません・・・。

また、その遺伝子をE.coli内で過剰発現させる場合、強力なプロモーターを使うことは想像つくのですが、DNAをプラズミドに挿入する時に一緒に混ぜてしまえば良いのでしょうか?何処でどう組み込めばいいのか、こちらも方法がよくわかりません。

分かる方ご回答頂けると助かります。宜しくお願いします。

Aベストアンサー

ヒトの染色体を切り刻んで全部プラスミドに挿入してから、「特定の
遺伝子」が入ったプラスミドを探すようなイメージを持っていらっしゃる
のでしょうか?「特定の遺伝子」を発現させたい場合は、そんなことは
しません。

多くの場合、プラスミドに挿入したいcDNAをあらかじめPCRなどで
増幅したうえ精製しておくので、「特定の遺伝子」が選択的に組み込まれ
ます。

プロモーターに関しては、市販のプラスミドの遺伝子挿入部位(マルチ
クローニングサイト)の上流に、あらかじめプロモーターが組み込まれて
いるので、挿入する遺伝子に組み込んでおく必要はありません。

Qa,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1

a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を
満たすs,tが存在するとき、x^2-(a+d)x+(ad-bc)=0
の解は、2つの異なる実数解で-1<x<1に存在することを示せ。

つぎの流れで考えました。
f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)
この(1)(2)(3)を示せればよい。
s(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0これと同値は両辺を足したものと掛けたものがどちらも正であるから、
s(1-a-c)+t(1-b-d)>0・・・(4),-s^2c(1-a)+st{(1-a)(1-d)+bc}-t^2b(1-d)>0・・・(5)
これを満たすs,t が存在するということをどう(4)(5)に反映させるかが分からなく、ここで行き詰まりました。このあとどうすればいいのか、よろしくお願いします。

a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を
満たすs,tが存在するとき、x^2-(a+d)x+(ad-bc)=0
の解は、2つの異なる実数解で-1<x<1に存在することを示せ。

つぎの流れで考えました。
f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)
この(1)(2)(3)を示せればよい。
s(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0これと同値は両辺を足したものと掛けたものが...続きを読む

Aベストアンサー

 質問者さんの方法に沿って考えてみると次のようになります。

>f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
>x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
> 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)

  ここはいただけません。
  この(1)~(3)は「a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を満たすs,tが存在する」ことを使わずに何を証明すれば良いのかを示しているだけですので、「(a+d)/2>0」は使わずに次のようにした方が良いです。
  f(±1)>0 ⇔ 1干(a+d)+ad-bc>0 ⇔ (1干a)(1干d)-bc>0 (複号号順) ・・・(3’)


>この(1)(2)(3)を示せればよい。
  ここまではOKです。


>s(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0これと同値は両辺を足したものと掛けたものがどちらも正であるから、
>s(1-a-c)+t(1-b-d)>0・・・(4),-s^2c(1-a)+st{(1-a)(1-d)+bc}-t^2b(1-d)>0・・・(5)

 ここは次のようにすると良いと思います。
  s(1-a)-tb>0 ・・・(A)
  -sc+t(1-d)>0・・・(B)
 
 とりあえず式(A)(B)を変形して次の関係を得ます。(質問者さんは既に分かっているようですが、次の展開のためにここで言っておきます。)
  s(1-a)>tb ∴0<a<1  ・・・(C)
  t(1-d)>sc ∴0<d<1  ・・・(D)

 式(A)×c+式(B)×(1-a)としても不等式の向きは変わらないので次の関係が成り立ちます。
  t{(1-a)(1-d)-bc}>0
 ∴(1-a)(1-d)-bc>0   ・・・(E)
 また(C)(D)(E)から次の関係も成り立ちます。
  1+(a+d)+ad-bc>0
 ∴(1+a)(1+d)-bc>0  ・・・(F)

 ここまでのことから(C)(D)は条件(1)を示し、(E)(f)は条件(3)を示しているので、後は条件(2)だけを示せば良い。
 ところで条件(2)の右辺は
  (a+d)^2-4(ad-bc)=(a-d)^2+bc>0
と変形できて条件(2)を満足させることが示される。

 従って、以上のことから 与えられた2次方程式の解は2つの異なる実数解で-1<x<1に心材することが示された。



 あとはこのままの証明では行ったり来たりで煩雑になりますので、順番を前後逆にして記述すると良いと思います。

 質問者さんの方法に沿って考えてみると次のようになります。

>f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
>x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
> 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)

  ここはいただけません。
  この(1)~(3)は「a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を満たすs,tが存在する」ことを使わずに何を証明すれば良いのかを示しているだけですので、「(a+d)/2>0」は使わずに次...続きを読む

Q蛋白の過剰発現

こんにちは。早速質問です。
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ところが、腫瘍組織においてIGF-1R mRNAレベルは、正常組織と同程度、または正常組織より発現量が低いのです。
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Aベストアンサー

転写・翻訳が低くなっているのに蛋白質が多くあるなら、蛋白質の分解が抑えられているのでは?


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