現在読んでいる文献の中に、”相補的DNAを導入し過剰発現を行った”との記述があったのですが、どのような原理なのでしょうか?
使用している細胞はCOS細胞で、発現したタンパクはシャペロンの一つBiPのwild typeです。
よろしくお願いします。

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A 回答 (3件)

rei00さんの言う通り、この機会に分子生物学の基礎から本を読み直すことが、一番のいい理解方法ですが、一応、そのpaperの指摘されている記述(それだけの表現で的確に説明できているかどうか不安ですが)について、簡単に説明します。

(基礎的なことなので、そんなの知ってるのに!!と思われるかも知れませんが…)
蛋白の合成は、まず、targetの蛋白の情報を持つDNA(情報鎖)に対して相補的な配列を持つ側のDNA鎖(鋳型DNA)からDNAの情報がmRNAに転写されます。この情報鎖DNAとmRNAの蛋白質コード部分は塩基の中でチミンとウラシルの違いがありますが、(原理的には)同じ塩基配列を持つことになります。
そのmRNAがリボゾーム上に結合し、そこで翻訳され、対応するアミノ酸がアミノ末端からカルボキシル末端に向かう方向で次々と結合していき、翻訳が終了すると、リボゾームから切り離されて、蛋白の合成が終了します。
しかし、いくらtargetの蛋白のDNAを宿主細胞に導入しても、細胞内のDNAaseで分解されたり、増殖が不十分で希釈されてしまって、意味をなさなくなってしまいます。
そこで、問題の相補的DNA(cDNA)ですが、これは通常バクテリアをベクターとして用いて蛋白の発現を行うときに用いられます。真核生物のDNAにはmRNAに転写されないintronという余計な塩基配列(介在配列)があり、mRNA転写時にはこの部分が取り除かれて翻訳に必要な塩基配列(exon)だけになります(この現象をRNAスプライシングと言います)。このintronを含むDNA断片を組み込んだベクターを原核生物である宿主のバクテリアに導入しても、バクテリアにはスプライシング機構は持っていないので、蛋白の発現ができません。そこで、targetの蛋白のmRNAを上手く細胞から単離して、これに逆転写酵素を働かせることによりmRNAとそっくりなcDNAを調製し、これを宿主ベクター系に導入することにより、蛋白を発現させます。現在はDNAシンセサイザーにより、人工的にcDNAを合成することも可能です。
しかし、ただ単に情報鎖のみのcDNAを導入しても蛋白発現は上手くいきません。このために、蛋白の発現を調節する調節領域(プロモーター)を目的遺伝子のすぐ上流にセットして、宿主ベクターのRNAポリメラーゼにより上手く認識され転写が進むようにする必要性があります。バクテリアの場合はもちろん、SD配列(Shine-Dalgarno配列)を直前に入れておく必要もあります。これらの調節領域は宿主に適したものを選ぶ必要があり、cDNAに組み込む手間はありますが、人工的にcDNAを合成するのであれば、はじめからこの部分を含んだ塩基配列通りに合成することができます。
質問中にあった「過剰発現を行う」のであれば、おそらくその目的に応じた調節領域を組み込んだcDNAを導入したのでしょう。
さっと流した文章の中に、「ベクター」と「宿主」という言葉がありますが、蛋白の発現を行う場合、自己増殖機能を持った環状の小さなDNA分子を持つプラスミドに調節領域等を入れた目的DNAを組み込み(プラスミドベクター)、これをバクテリアに導入することにより、バクテリア内で蛋白が発現されます。
今回の場合は、COS細胞において蛋白の発現を行っているようですので、その細胞に応じたベクターに、その細胞に応じた調節領域を入れたcDNAを組み込んで、それをCOS細胞内に導入して、蛋白の過剰発現を誘導したのでしょう。
私も実際に行っているわけではなく、文献や教科書等で得た知識しかないので、求められている答えが導き出せているか、何とも心許なく思っておりますが、COS細胞における詳細な蛋白発現法については、秀潤社の「細胞工学」別冊のバイオ実験イラストレイティッド等の本を読まれると最も良いでしょう。(下記URL参照)「蛋白質 核酸 酵素」にも、紹介があるかも知れません。
頑張って研究してください。

参考URL:http://www.shujunsha.co.jp/saihome.html

この回答への補足

わかりやすいご説明ありがとうございます。
すみません。質問の説明が足りなかったようです。
この文献では他のタンパクの発現も行っているのですが、それぞれにベクターやプロモーターの解説があり、ご説明頂いたような手順で導入しエレクトロポレーションしているようなのですが、過剰発現の系に関してだけはcDNAをマイクロインジェクトしたとの記述しかありませんでした。
そこで、cDNAが1本鎖であるがゆえの何か特異的な反応があり、勝手に過剰発現してしまうのかと思ったわけです。
参考書等を探してもcDNAを直接導入しての過剰発現と言う記述は見つける事ができませんでした。
ネット上では、cDNAを使用して過剰発現を行ったとの記述はよく見るのですが、詳しい原理については見つける事が出来ませんでした。
ただ、検索エンジンですぐに引っかかるので、メジャーな手法なのかと思い、専門の方ならcDNAと過剰発現がすぐに結びつくのかと思い、あのような質問の形式にしてしまいました。
説明不足を重ねてお詫びします。
私の研究内容とは直接関係ないのですが、訳あって後輩に専門外の文献を指導しなければならない立場にあります。
というわけで、この質問をもう少し継続したいのですが、アドバイスよろしくお願いします。

補足日時:2001/05/31 15:46
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相補的DNAとはcDNAと表記されていませんでしたか?


もしそうであるならば、これはmRNAに対する相補的DNAのことです。
すなわち、BiPをコードするmRNAをとってきて、これに対する相補的DNAを
逆転写反応で作製し、DNAの形にしてから、ベクターにつなぎ、細胞に導入します
すると目的のタンパクがそこから発現するということになります。

過剰発現は、プロモーターを強いものにして通常より多く発現させることで、
目的タンパクの機能を明確に示すために行われます。
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文献を読んでられるという事はある程度きちんとした知識が必要だと思います。



それでしたら,図書館に行って「細胞生物学」,「分子生物学」,「遺伝子工学」,「生化学」等の教科書を探して見て下さい。

かならず記述があると思います。こうやって,知識を増やしていって一人前の研究者(専門家)になっていくのですよ。

あ,その際に細胞の違いとかタンパク質の違いは気にしないで下さい。原理は同じですから。
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また、たった区別の方法があるのでしょうか。

基本的な質問ですみません。回答をよろしくお願いします。

Aベストアンサー

『目的のタンパク質のDNAの相補的DNAをベクターに組み込んでそれを腫瘍細胞に形質導入するという方法を見つけたのですが、それで、過剰発現させることができるのでしょうか。』
pcDNA3.1 (Invitrogen)などの薬剤耐性遺伝子を含む発現ベクターに目的の遺伝子を組み込んでLipofectamin (Invitrogen)やFuGENE (Roche)などの試薬を使って細胞に導入する方方が一般的です(した)が、今はレンチウイルスにパッキングして細胞に導入する方が効率が良いのでそちらを好む人が増えています。

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Aベストアンサー

データが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。また母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。
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Aベストアンサー

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参考URL:http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW2/MG234.html

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
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ご参考までに。

Qプルダウンアッセイ

プルダウンアッセイとはどういうものか教えて下さい。

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以下の参考URLが参考になりますでしょうか?
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●http://www.nig.ac.jp/labs/AR97ja/3/A/Aa2-4.html
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●http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/bnsikato/manualf/e6.html
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ご参考まで。

参考URL:http://www.my-pharm.ac.jp/~khigashi/higashi/protocol/pulldown.htm

Qホルマリン

『ホルマリン』は『中性ホルマリン』とは別物ですか?
中性ホルマリンが必要なのですが、今手元にあるものに『ホルマリン』と表示されています。

Aベストアンサー

1点だけご確認ください.
10%ホルマリン溶液はリン酸bufferで調製しますが,そのリン酸bufferを蒸留水で調製したものと,生食で調製したもの(PBS)と使い分ける場合があります.

指定がありますか?
なければ蒸留水の方でよろしいかと思います.

ウチの会社のレシピは以下のようになっています(10L調製).
1)リン酸二水素カリウム(KH2PO4)…25g
2)リン酸水素二ナトリウム12水和物(Na2HPO4・12H2O)…170g
3)ホルマリン原液…1000mL

1),2)を蒸留水(水道水でも可)にきちんと溶解させて5~7L(だいたいでOKです)とする.
その後,3)を加える.
最後に蒸留水(水道水でも可)を加えて全量を10Lとする.

余談ですが,ウチでは他の固定液との混合をさけるために,1%エオジン水溶液を数滴たらしてわずかに赤くしています.固定の浸透力に対するエオジンの影響はほとんどありません.

1),2)が上記と水和物の数などが異なる場合,水以外のmol数が大体同じであればOKですから,計算して求めてみてください.

1点だけご確認ください.
10%ホルマリン溶液はリン酸bufferで調製しますが,そのリン酸bufferを蒸留水で調製したものと,生食で調製したもの(PBS)と使い分ける場合があります.

指定がありますか?
なければ蒸留水の方でよろしいかと思います.

ウチの会社のレシピは以下のようになっています(10L調製).
1)リン酸二水素カリウム(KH2PO4)…25g
2)リン酸水素二ナトリウム12水和物(Na2HPO4・12H2O)…170g
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1),2)を蒸留水(水道水でも可)にきちんと溶解させて5~7L...続きを読む

Q遺伝子改変マウスについて

趣味で生物学を勉強している者です。最近は様々な遺伝子を潰したり入れたりしているマウスがあるようですが、その名称で混乱している部分があるので質問させていただきます。ノックアウトマウスは特定の遺伝子を欠損させているというのは理解できますが、その逆のノックインマウスとトランスジェニックマウスは両者にどのような違いがあるのでしょうか?

よろしくおねがいします。

Aベストアンサー

トランスジェニック(遺伝子導入)は、文字通りある生物のゲノムに(染色体に組み込まれたかたちで)、人為的に外来の遺伝子を導入したものです。ですから、ノックアウトにせよノックインにせよ、トランスジェニックの一種です。組み換えDNA実験の法令のなかでも、すべて遺伝子導入生物として扱われます。

実際の現場では、トランスジェニックは、特に外来の遺伝子を染色体上の不特定の場所に挿入させることをさします。たとえば、ある変異の原因遺伝子がこれであるということを証明するために、正常な遺伝子を導入することで変異体の表現型が回復するかどうかを見るような場合に使います。マウスでは、受精卵にDNAを注射して、妊娠マウスに借り腹させて作成します。

ノックアウトは、ある遺伝子をつぶしたときにどういう異常が起こるかを見るために行われます。これは、狙った遺伝子と相同な配列を持ち、内部に遺伝子の機能を失わせるような欠失や挿入、あるいはストップコドンなどを導入したDNAを入れて、相同組み換えによってゲノム上の遺伝子と入れ替えることによって行います。うまく相同組み換えがおこる頻度は非常に低いので、受精卵に注射するのではなく、細胞培養実験のテクニックを利用して、多数の胚性幹細胞(ES cell)に、どばっとDNAを導入して、そのなかから、うまくいったものをスクリーニングするという方法がとられます。これを、別に採取した胚に移植して作成します。詳しいことは割愛します。

ノックインは、ノックアウトと同様に作成しますが、ゲノム上の遺伝子と入れ替える部分に、何か機能的な遺伝子を入れておくところが違います。たとえば、ある遺伝子の内部にGFP(クラゲ由来の蛍光たんぱく質)遺伝子を導入すると、その遺伝子の発現する場所や時期が、蛍光によってモニターできるようになります。最近では、ノックアウトを目的とする場合でも、発現の指標となるような遺伝子のノックインが同時にできるようにデザインすることが普通になってきました。

トランスジェニック(遺伝子導入)は、文字通りある生物のゲノムに(染色体に組み込まれたかたちで)、人為的に外来の遺伝子を導入したものです。ですから、ノックアウトにせよノックインにせよ、トランスジェニックの一種です。組み換えDNA実験の法令のなかでも、すべて遺伝子導入生物として扱われます。

実際の現場では、トランスジェニックは、特に外来の遺伝子を染色体上の不特定の場所に挿入させることをさします。たとえば、ある変異の原因遺伝子がこれであるということを証明するために、正常な遺伝子を...続きを読む

Qプロモーター領域

ある既知のタンパク質遺伝子のプロモーター領域の配列を知りたいというときにはどのように検索すればよろしいのでしょうか。
タンパク質そのものの配列までは調べられたのですが…その後がよくわからなくて。

Aベストアンサー

実験的に同定するのは結構手間です。
まず、転写開始点を正確に決めておく必要があります。
簡便には、5' RACEの産物の端がどこにきてるかで見てもいいと思いますが、完全に伸びきっていない逆転写産物もPCRで増やしてしまうので、多少のあいまいさがでてきます。
正確に決めるには昔ながらのprimer extensionやS1 mappingが必要でしょう。
で、プロモーターは(発現をmodulateするエンハンサーは話が別です)、典型的には転写開始点の-50 bp以内にあります。たとえば、真核生物では、-20 bp 前後にTATA boxまたはGC box、さらに-15 bp くらい上流に-CAATboxとか。そういう典型的な配列があれば、8割がたそこがプロモーターだという蓋然性を言うことができます(かならずしも典型的なプロモーターばかりではありませんが)。
ちゃんと実験的に証明しようとしたら、候補となる領域にレポーター遺伝子をつないで、in vitroやin vivoで転写活性を調べなければならないでしょう。システマティックに欠失シリーズや、点突然変異を作って、どの配列がプロモーター活性に必要十分であるかを明らかにすれば完璧です。

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Q遺伝子に関するしつもんなんですがmyc遺伝子って・・・

遺伝子に関するしつもんなんですがmyc遺伝子っていったい何ですか?腫瘍マーカーか何かですか?よろしくお願いします!

Aベストアンサー

mycの産物はDNAに結合する蛋白質で、正常では転写因子として働いています。変異すると細胞ががん化することがあります。バーキットリンパ腫におけるmycの変異が代表的。

変異によって細胞ががんになる遺伝子を癌遺伝子といいます。mycは癌遺伝子のひとつでもあります。

細胞ががん化にしたときにだけ、細胞の性質が変わることによって特に多く産生する分子(蛋白質やペプチドなど)を腫瘍マーカーといいます。癌遺伝子とは違います。

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/癌遺伝子


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