あるターゲットとする遺伝子のクローニングをして配列決定できたとして、果たしてそれが本当にターゲットとする遺伝子なのか?どうやって確かめられるのですか?
私が考えたのは
1精製しているタンパクのシークエンスと照らし合わせる
2近種の同じ遺伝子との相同性で見る 
3発現ベクターで発現させる
しかし、1も2も100%それで正しいと言えるかというとそうではないと思うし3では時間がかかりすぎると思うのです。きっとなにかあっそんなことか~とわかる理由があると思います。どなたかアドバイスください。  

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A 回答 (3件)

ターゲットの遺伝子の配列が決定できたその経緯にもよると思います。


具体的に何かこういったことを実験で進められているのでしょうか?

ですが、遺伝子のコードする蛋白の確認としては、やはりベクターで発現し、発現された蛋白について、(targetの蛋白が酵素なのか、何なのか明言されていませんが)、その蛋白に対する抗体があるのであれば、蛋白をウエスタンブロッティング後に免疫染色をしてみて同定するとか、酵素であれば活性があるかどうか確認するとか、あるいは、何か特定の疾患で特定の細胞に検出される蛋白であるなら、in situ をしてみて、そのmRNAの局在が抗target蛋白抗体のものと比較してみてどうだかを確認するといった手段がいいのでは?

真核生物の場合は、遺伝子の中にintronとexonが存在するため、なかなか複雑になってくるかも知れませんが、一度DNAシンセサイザーで合成してみて、それを発現させ、産生された蛋白のアミノ酸配列をチェックするのは必須だと思います。
とにかく、ただ一つの方法だけで、それと確定できるわけではなく、こういったことを確認するためには、かなりの時間とお金と労力が必要であることは覚悟すべきでしょう。

実際に遺伝子の研究をなさっている方が回答されるのが一番だとは思いますが、秀潤社の「細胞工学」の「バイオ実験イラストレイティッド」を見てみては?
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クローニングするということは,その遺伝子に着目した理由があると思います.例えば,新規の転写因子を同定するとか,ある酵素活性を有する

タンパクが新規らしいので遺伝子を同定するとか,あるいはある形質を示す細胞株や動物で特異的に発現している遺伝子を同定するとかなど.このような目的の場合は,クローニングした遺伝子がコードするタンパクもまたその性質を有していなければいけないですよね.ならば,最終的には3のような方法を用いて産物の性質を確認することは必要不可欠だと思います.
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タ-ゲットとする遺伝子をX,配列を決めた遺伝子をYとします。

御質問はX=Yをどうやって決めるかですね。

これはXが示す性質全てをYが示すという事を確かめるしかありません。

この場合,Xがどんな性質を示すかによって,お書きの1,2で充分な場合もあるでしょうし,3までやっても不十分な場合もあり得ます。

ただ,研究において必要であれば,時間がかかりすぎるからやらないという事は通用しません。また,そんなに簡単な方法だけで研究を進められるものでもありません。

具体的には,「ターゲットとする遺伝子のクローニングをして配列決定」した結果を報告している論文を読んでみられればお分かりになると思います。
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QDNAのA=C,T=Gの組み合わせはなぜ無いのか?

生物学を勉強しているのですが、DNAの構造はアデンとチミン、グアニンとシトシンの組み合わせがあると教わりました。なぜ4つあるのにアデンとシトシン、チミンとグアニンといった他の組み合わせが出来ないのでしょうか?

Aベストアンサー

塩基の分子構造から、それぞれAとT、GとCが水素結合という結合で
引きあうことができるのに対して、他の組み合わせでは、うまく合わないのです。
ただし、AとGは、弱いながらも引きあいます。といっても、AとTやCとGよりは
ずっと弱いので、それらの組み合わせには大差で負けてしまいますが。

参考URL:http://www.chem-station.com/yukitopics/dna.htm

QTAクローニング用ベクター

TAクローニング用ベクターって自分で作ることはできないんでしょうか?回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

できます。

割と有名な論文です。PubMedで全文読めます。

Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19(5):1154.
Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products.
Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS.

Qプレゼンの素材探しています。(二重螺旋構造)

プレゼンようにきれいなスパイラルもしくは、DNAの二重螺旋構造をイメージしたPower Pointで使えるクリップアートを探しています。PPTに貼り付けるので出来るだけきれいなものを探しています。急いでいますので、何方か助けて下さい。

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googleのimage(イメージ)で検索してみると

Double helixで検索結果
http://images.google.co.jp/images?q=Double%20helix&hl=en&lr=&c2coff=1&safe=off&sa=N&tab=wi

spiralで検索結果
http://images.google.co.jp/images?q=spiral&hl=en&lr=&c2coff=1&safe=off&sa=N&tab=wi

でした。

Q遺伝子発現?

遺伝子の発現とは簡単に言うとどういうことなのでしょうか?

教科書等にも載っているのですがイマイチよくわかりません。
教えて下さい!

Aベストアンサー

生物は細胞から成り立っています。
細胞には、DNAが入ってます。
DNAは、生物が生きていくために必要な、全ての情報が含まれています。
(性別、目の色、神経、手足、・・・等々)
この、性別を決定する情報や、手を構成する情報、1つ1つの情報を、「遺伝子」と呼びます。

辞書を見たことはありますよね。
辞書一つには、「あ」から「ん」までのたくさんの情報が記されています。
でも、開くページによって、記載されている情報は異なります。

遺伝子もそうです。
DNAという辞書を持ち、遺伝子というページを開く。

目では、例えば「水晶体」というページ(遺伝子)を開くから水晶体が形成される。
手では、例えば「爪」というページを開くから爪が形成される。

このことを、「遺伝子が発現する」といいます。

Q{d∫(a~x)f(t)g(t)dt}/dxの導関数

aを定数として、
{d ∫(a~x)f(t)dt}/dx は、
∫(a~x)f(t)dt = F(x)-F(a)より
{d ∫(a~x)f(t)dt}/dx = dF(x)/dx-dF(a)/dx
             =f(x)
となるのは分かるんですけど、
{d ∫(a~x)f(t)g(t)dt}/dx は h(t)=f(t)g(t)とおいて
{d ∫(a~x)h(t)dt}/dx = h(t) = f(t)g(t) とやっていいんですか?

Aベストアンサー

いいんじゃないですか?
ただ、{d ∫(a~x)h(t)dt}/dx = h(x) = f(x)g(x)だと思いますけど。 

Qクローニングベクター

約1700bpのPCR産物をクローニングしたいのですが、サイズ的にZero Blunt TOPO PCRクローニングキットの3.5kbpのベクターでも可能でしょうか?

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Qx(t+1)=A・x(t)^α/(B・x(t)-C)が定常解を持つ条件

x(t+1)=A・x(t)^α/(B・x(t)-C)が定常解を持つ条件について

A,B,Cは、定数になります(x(t)>C/Bとします)。
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Aベストアンサー

これに気付け!
f(k)=Bk^2-Ck-Ak^α=k^α(Bk^(2-α)-Ck^(1-α)-A)について考える。ただし、k>C/Bとする。
f(k)=0ということはk^α=0になるかBk^(2-α)-Ck^(1-α)-A=0になるかいずれかである。
(1)k^α=0のとき、これはC/B<0かつ0<α<1のときでしかk^α=0なるkの存在性は成り立たない。(各自なぜそうなるか確かめよ)
(2)Bk^(2-α)-Ck^(1-α)-A=0の場合を考える。
ここでg(k)=Bk^(2-α)-Ck^(1-α)-AとおくとC/B≧0ならばAB>0でなければいけない。逆にC/B<0ならば
g'(k)=k^(-α){B(2-α)k-C}でk=c/B(2-α)のときはg'(k)=0でg(k)は極値を持っている。(本当は
厳密に示さんといけないが、ここでは省略。)
そしてB>0のときg(c/B(2-α))<0でB<0のときg(c/B(2-α))>0
すなわちB×g(c/B(2-α))<0でなくてはいけない。

よって(1)(2)合わせるとC/B≧0かつAB>0・・・・答え の場合と
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ここでg(k)=Bk^(2-α)-Ck^(1-α)-AとおくとC/B≧0ならばAB>0でなければいけない。逆にC/B<0ならば
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Q遺伝子のクローニング

ある遺伝子Xを発現させるためのプラスミドを作りたい場合、遺伝子Xの上流(プロモーター)と下流(ターミネーター)はそれぞれどの程度あれば(ORFと一緒にクローニングすれば)よいのでしょうか?遺伝子によって違うとは思うのですが、一般的にはどれぐらいなのか教えてください。

Aベストアンサー

培養細胞に、ORF全長を強制発現するのであれば、cDNA全長(1st メチオニンからストップコドン)まであれば十分です。一方、組織特異的な転写因子をゲノムごと細胞にいれても、その組織由来の細胞であってもちゃんと発現できない場合も多いと思います(キロ~メガbp)。
目的が強制発現(過剰発現、ectopic expression)であれば簡単ですが、ゲノムからの発現であれば、BacやYacといったベクターを用いた大がかりな実験になるとおもいます。
ご参考になれば幸いです。

Qa,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1

a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を
満たすs,tが存在するとき、x^2-(a+d)x+(ad-bc)=0
の解は、2つの異なる実数解で-1<x<1に存在することを示せ。

つぎの流れで考えました。
f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)
この(1)(2)(3)を示せればよい。
s(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0これと同値は両辺を足したものと掛けたものがどちらも正であるから、
s(1-a-c)+t(1-b-d)>0・・・(4),-s^2c(1-a)+st{(1-a)(1-d)+bc}-t^2b(1-d)>0・・・(5)
これを満たすs,t が存在するということをどう(4)(5)に反映させるかが分からなく、ここで行き詰まりました。このあとどうすればいいのか、よろしくお願いします。

a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を
満たすs,tが存在するとき、x^2-(a+d)x+(ad-bc)=0
の解は、2つの異なる実数解で-1<x<1に存在することを示せ。

つぎの流れで考えました。
f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)
この(1)(2)(3)を示せればよい。
s(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0これと同値は両辺を足したものと掛けたものが...続きを読む

Aベストアンサー

 質問者さんの方法に沿って考えてみると次のようになります。

>f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
>x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
> 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)

  ここはいただけません。
  この(1)~(3)は「a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を満たすs,tが存在する」ことを使わずに何を証明すれば良いのかを示しているだけですので、「(a+d)/2>0」は使わずに次のようにした方が良いです。
  f(±1)>0 ⇔ 1干(a+d)+ad-bc>0 ⇔ (1干a)(1干d)-bc>0 (複号号順) ・・・(3’)


>この(1)(2)(3)を示せればよい。
  ここまではOKです。


>s(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0これと同値は両辺を足したものと掛けたものがどちらも正であるから、
>s(1-a-c)+t(1-b-d)>0・・・(4),-s^2c(1-a)+st{(1-a)(1-d)+bc}-t^2b(1-d)>0・・・(5)

 ここは次のようにすると良いと思います。
  s(1-a)-tb>0 ・・・(A)
  -sc+t(1-d)>0・・・(B)
 
 とりあえず式(A)(B)を変形して次の関係を得ます。(質問者さんは既に分かっているようですが、次の展開のためにここで言っておきます。)
  s(1-a)>tb ∴0<a<1  ・・・(C)
  t(1-d)>sc ∴0<d<1  ・・・(D)

 式(A)×c+式(B)×(1-a)としても不等式の向きは変わらないので次の関係が成り立ちます。
  t{(1-a)(1-d)-bc}>0
 ∴(1-a)(1-d)-bc>0   ・・・(E)
 また(C)(D)(E)から次の関係も成り立ちます。
  1+(a+d)+ad-bc>0
 ∴(1+a)(1+d)-bc>0  ・・・(F)

 ここまでのことから(C)(D)は条件(1)を示し、(E)(f)は条件(3)を示しているので、後は条件(2)だけを示せば良い。
 ところで条件(2)の右辺は
  (a+d)^2-4(ad-bc)=(a-d)^2+bc>0
と変形できて条件(2)を満足させることが示される。

 従って、以上のことから 与えられた2次方程式の解は2つの異なる実数解で-1<x<1に心材することが示された。



 あとはこのままの証明では行ったり来たりで煩雑になりますので、順番を前後逆にして記述すると良いと思います。

 質問者さんの方法に沿って考えてみると次のようになります。

>f(x)=x^2-(a+d)x+(ad-bc) とおくと、y=f(x)のグラフは、-1<軸<1から、-2<a+d<2・・(1)
>x軸と異なる2点で交わるから、判別式=(a+d)^2-4(ad-bc)>0・・(2)
> 軸=(a+d)/2>0より、f(1)>0よって、1-(a+d)+ad-bc>0・・(3)

  ここはいただけません。
  この(1)~(3)は「a,b,c,d,s,tは正の数でs(1-a)-tb>0,-sc+t(1-d)>0を満たすs,tが存在する」ことを使わずに何を証明すれば良いのかを示しているだけですので、「(a+d)/2>0」は使わずに次...続きを読む

QCREB発現ベクター

レポーター遺伝子を用いて転写活性を測定しているのですが、その際にclontech社のp-CMV CREBというプラスミドを同時に過剰発現させています。
しかし、あまり効果が見られず一体どうしたことかと思っております。
何か情報をお持ちの方、または実際に使用されている方の感想などお聞きできればと思っております。

Aベストアンサー

補足有り難うございます。

>アッセイ系としましてはpGL3 vectorを用いたルシフェラーゼ活性の測定によるもので、細胞はrat-cortical neuronのprimaryです。

なるほどtranfectionの実験系としても、少し難しそうな系ですね。FuGENEとかお使いなんでしょうね。

>CREレポーター(stratagene)も用いたのですが、やはりそれほどの活性上昇は認められず・・・

この系はTATAの最小プロモーターなのでシグナルが弱いことが多いようです。

>フォルスコリンのような活性化剤はある遺伝子での活性上昇は認めていますのでcAMP系のシグナルは働いています。

なるほど。

>少し思うのですが、転写因子の過剰発現というのはどの程度の活性変化が見られるのでしょう。転写因子余剰の場合、シグナルによる活性化(率)というのは相対的に減ってしまうんじゃないかなと最近危惧しています。

Case by caseです。
最近は活性化していない転写因子は、corepressorをrecruitしてしまうという話もありますので、その危惧は正しいともいえます。ドミナントアクティブ体を作製してoverexpreeionさせるしか、その答えは明らかにならないと思います。
 ちょっと思ったのですが、CREBのリン酸化がほんの一瞬だけ起こっているということはないでしょうか?昔、サイトカインでのCREの応答が非常に弱いので不思議に思っていた折、リン酸化部位抗体を用いてWestern blottingしてみました。すると刺激後10分位でCREBが活性化していたのですが、一時間後では元のレベルに戻っていました。レポーターアッセイというのは、一晩後とかのルシフェラーゼの蓄積で見る系ですから、この一瞬のactivationはdetect出来なかったわけです。もちろん、1時間後くらいでは、シグナルは弱くて見れませんでした。LPS刺激のときはレポーターでも十分シグナルは見られますが、これは24時間にわたって、ずっとCREBが活性化されていたせいでした。
 このようなこともありましたので、一度、調べて見てはいかがでしょうか?

補足有り難うございます。

>アッセイ系としましてはpGL3 vectorを用いたルシフェラーゼ活性の測定によるもので、細胞はrat-cortical neuronのprimaryです。

なるほどtranfectionの実験系としても、少し難しそうな系ですね。FuGENEとかお使いなんでしょうね。

>CREレポーター(stratagene)も用いたのですが、やはりそれほどの活性上昇は認められず・・・

この系はTATAの最小プロモーターなのでシグナルが弱いことが多いようです。

>フォルスコリンのような活性化剤はある遺伝子での活性上昇は認...続きを読む


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