HPLCとゲル濾過の違いについてです。

初投稿です。よろしくお願いします。

今学校の研究の作業の一つで、コラーゲンを生体内酵素で消化して、その消化物の抗酸化能を調べています。

そして今、その消化物を分離する作業をやっています。

ペプシンとトリプシンとエラスターゼにおける消化物を分離するのですが、

トリプシンとエラスターゼの消化物はHPLCで分離するのに対し、

ペプシンはゲル濾過で分離するように言われました。

ペプシンはなぜHPLCではなくて、ゲル濾過で分離しなくてはならないのでしょうか？

来月、研究発表があるので、なるべく早め回答を希望です。

よろしくお願いします。

No.2 回答者： yasto 回答日時： 2014/02/14 02:46

お使いのHPLC のカラムはいわゆる逆相のカラムで、対象の疎水性の程度の違いで分離します。

一方、ゲルろ過は、対象分子の大きさで分離します。
さて、ここまでは、簡単にこたえられるのですが、これ以上はどんな配列のコラーゲンなのか、生成物の特性をどう予測しているのか等が分からないと、答えられません。案外経験則なのかもしれません。
頼りない返事ですが参考にして下さい。

この回答へのお礼

回答ありがとうごさいます。
今は配列まではわかりません(酵素による消化物の配列を解析するテーマでもありました)が、使っているのはPorcineなので、豚のコラーゲンを用いて実験を行っていました。情報不足の中、答えていただきありがとうございます。

お礼日時：2014/02/16 07:04

No.1 回答者： ryo_ky 回答日時： 2014/02/06 12:47

ちゃんとした回答をするのには情報量がちょっと少ない様に思います。

ですので、参考程度の回答をします。

まず、ゲル濾過もHPLCも分離するための操作であることは質問者さんもご理解していると思います。
では各々の手法で分離できる理由（原理）で考えてみましょう。
どちらもカラム充填剤（若しくはゲル）と溶媒を用いて分離する方法です。
例えば分子の大きさ（分子量）、極性の有無などによって各々の物質の吸着しやすさが異なります。
つまり、溶媒と充填剤の種類によって各々の物質の分けやすさが違うと言えます。

Rf値というのはご存知でしょうか？
よく薄層クロマトグラフィーで使用されますが、充填剤にシリカゲル、適当な溶媒を利用してある一定距離を溶媒が浸透した時、分離したい目的物がどの程度を移動したかを見るものです。
大体Rf値が5以下がクロマトグラフィーに良いと言われています。

もし、質問に対して満足する回答を得たいのであれば、
使用したカラムの充填剤、溶媒、装置などを書いた方が良いと思います。

この回答へのお礼

丁寧なご回答ありがとうございます。
覚えてる範囲で書きます。
装置の名前までは見てないですが、全部自動でやってくれるやつじゃなくて、自分でPCに打ち込んで、インジェクションして、エッペン持ちながら、地道にサンプルを採取するやつです。
ゲルろ過に使ったけどカラムはTSKgelなんとかという名前で、HPLCにしようしたカラムはC-18という種類のカラムだと思います。
溶媒はA液で0.1%TFA(ミリQ水でメスアップ)B液で、20%のA液+アセトニトリルを使用しています。
Rf値について自分で調べてみたいと思います。

お礼日時：2014/02/06 21:26