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はじめまして。
論文購読で論文を読んでいるのですが、facsのヒストグラムの読み方、分析の仕方がわからず
困っています。もしお詳しい方がいらっしゃれば教えていただけないでしょうか。

そのグラフは下記url論文のfig4Cおよび5Aです。画像も添付しました。
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii …

①fig4Cのヒストグラムについて
下段の方がCD31の発現が大きくなっていて、さらに300µm(20 ng/mL)が一番良い、
という結果なのですが、領域M1の取り方がよくわかりません。
黒い線がアイソタイプコントロールだと思うので、
コントロールが含まれない領域をとった、ということで良いのでしょうか?

②fig4Cの300µm(20 ng/mL)とfig5Aについて
fig5Aは300µm(20 ng/mL)のサンプルからCD31を発現している細胞をソートする、
またその割合を求めるものだと思います。
fig4Cにおけるヒストグラムとfig5Aの点が密な部分が一致しないように思うのですが、
なぜでしょうか?

教えていただければ嬉しいです。
宜しくお願いします。

「facsのヒストグラム 読み方」の質問画像

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A 回答 (1件)

>コントロールが含まれない領域をとった、ということで良いのでしょうか?



基本的にはそういうことです。この場合発現がバックとかぶってるのでどこがポジがネガがは判断は容易ではありませんので、とりあえずバックで0%になるところで引いてるだけでしょう。かぶってる場合にCD3 hi, CD3 med, CD3 low なんて取り方をすることだって良くあります。

2コ目の話は、少なくとこの図を見ただけだと別ものだともおうんですが…読み間違えてないですか? 少なくともhistgramにすれば山が2つ出てくるハズなので、クルードのサンプルかなんかだと思いますし、縦軸がFSC SSCではないともうので何かもわからんですが、一応ネガティブを取ってるみたいですしね。仮に上の黒と色の細胞の混ぜ物だとしても、横軸が違いすぎるので染色方法がこれだけズレるのは考えにくいし…。さすがに論文になってるならレビューで突っ込まれるとおもうので、質問者さんの読み違いじゃないですか?

ちなみにソーティングするときはぎりぎり左端まで取るとアウトライヤーでネガティブを拾いやすくなったりするので、きわどい分離の時は上の方半分の山にかかるようにして確実に発現の高いものを回収したりもします。これだけ綺麗に分離してれば大丈夫でしょうが。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます
2つ目の話は、ゲーティングしているのかな、と思います。
論文中にはfacs解析についてあまり詳しく書かれていないので確信はもてませんが…
ソーティングについても教えていただきありがとうございました。
やはり論文を読むときに困るので、facsの基礎からきちんと学ぼうと思います。

お礼日時:2016/05/12 15:18

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ROS(活性酸素種)の測定法についての部分なのですが、FACS analysisによる分析です。
http://www.stiftung-dhd.de/fileadmin/dhd_user/docs/2007-Diabetes-EPC-eNOS.pdf
上記URLで紹介している論文の4ページ目(A)のグラフです。

このグラフ全体が示していることは、全体の比較からわかるのですが、
FACS分析のFL3-H や SSC-H は何を示しているのかわかりません。
調べてみたのですが、恥ずかしながらイマイチ解りませんでした。
どなたか教えてください。

Aベストアンサー

ざっと見ただけですが、
FACSにおいて、 SSC-Hの意味はNo1さんのおっしゃるとおりですが、
この図での意味はNo1さんがおっしゃるのとはちがう思います。

まず、図2のAの左側の図ですが、
これはFACSの結果をドットプロットで表したものです。
ドットプロットの点の1つ1つが細胞の1つ1つです
(あまりに細胞数が多いときは、解析のときに見やすいように減らすときあり)。

そこで、この表示では縦軸と横軸という二次元であらわす必要があるのですが、
この図2では縦軸は何でもいいんです。といっても候補としては
SSC-HとFSC-H(細胞の大きさを表すものです)の2つになると思いますが。たまに、染めていない蛍光フィルターの数値を使う場合もあります。
つまり、縦軸はここでは意味はありません。

この辺は、もしFACSを知っている先生等がいらっしゃったら、展開の仕方を教わったらいいと思います。

そして、重要なのは図2Aの右側の図です。
これは縦軸が細胞数、横軸は蛍光強度を示しています。
ちなみにこのあらわし方はヒストグラムといいます。
縦軸が細胞数ということで、左の図と見比べてもらうと分かると思うのですが、
左の図でドット(細胞)が多いところが右の図の縦軸の山の高さと一致すると思います。
参考
http://www.med.kindai.ac.jp/immuno/facs.htm

横軸の値(山の場所)を見てもらうと分かると思いますが、diabeticの山は右に移動しています。これがスーパーオキシドアニオン量の増加を示しています。

このFACSの値は私の目には、結構違いがあるように見えますよ。

さらに、この論文では図2のBの説明文にあるように優位差検定をしてあります(論文中のRESEARCH DESIGN AND METHODSのStatistical analysis参照)。
P<0.05である場合、優位差があると言えますが、ここでは
*P<0.05、**P<0.001、***P<0.0001、+P<0.0001とあります。
よって差があります。

単純に見た目で判断ではないですよ。

参考までに。

ざっと見ただけですが、
FACSにおいて、 SSC-Hの意味はNo1さんのおっしゃるとおりですが、
この図での意味はNo1さんがおっしゃるのとはちがう思います。

まず、図2のAの左側の図ですが、
これはFACSの結果をドットプロットで表したものです。
ドットプロットの点の1つ1つが細胞の1つ1つです
(あまりに細胞数が多いときは、解析のときに見やすいように減らすときあり)。

そこで、この表示では縦軸と横軸という二次元であらわす必要があるのですが、
この図2では縦軸は何でもいいんです。とい...続きを読む

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