Competitive(RT-)PCRの原理は何とか理解したのですが、実際に定量実験をするときに、Competitorに具体的に何を使用して良いか分かりません。Competitorは市販されていて購入できるものなのでしょうか?
それとも自分で検討して、DNAなどを精製又は合成して加えるものなのでしょうか?
合成オリゴなどを使用するのでしたら Competitorの選択基準など教えてください。またPrimerなどもTargetに特異的なもの以外で使用するのでしたら是非教えてください。
今現在、細胞由来のmRNAの定量をしたいと考えているのですがノーザン法では余りうまくいきません。是非よろしくお願いします _(,~,)_

A 回答 (2件)

 昔少し行っていたので(昔なので間違って言っていたり、方法が変わっていたらごめんなさい)書きますが、RT-PCRってreverse transcription- polymerase chain reactionですよね。


 ほんでもって、Competitive(RT-)PCRは、対処となる標準mRNAを入れて
Competitiveに増殖させて、本当に目的のもが、頭打ちになった状態の増殖にならない様に行うと思ったのですが。違います??
 以下のHPでは合成したものを使用しています。自分のときは少し記憶があいまいでしたけど、増える事が分かって、濃度が測定されているRNAとプライマーを入れた記憶があります。同じ系でPCR行って、増えているかを見たと思います。
 RT-PCRも色々な方法がありますので、そちらも試されてはいかがですか?

参考URL:http://sockeye.sci.hokudai.ac.jp/Teaching/rtpcr. …
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こんにちは。


ご質問とはちょっと主旨が違うかもしれませんが、mRNAの定量を行うのであれば、現在の世間の主流はReal Time-PCRという方法だと思います。俗にTaqmanシステムなどと呼ばれています。
QC-PCRに比べ感度が高く、実際の手技も簡単だと思いますが、それ用の機械(ABIだと思います)を購入しなくてはいけなくて、コストが問題かもしれません。
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参考URL:http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/Transcrp.htm#processing

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(1)プライマーは,目的の遺伝子に特異的に結合しなければいけないので,十分な長さをもつ必要があります.だいたい20塩基前後でデザインして,データベース検索を行い,特異的であることを確認してください.

(2)2つのプライマーの長さは,違っていてもかまわないので,Tmを近づけてください.

(3)3’側の最後の塩基は,GかCがよいとされています(3重結合なのでAやTよりも強い).

(4)プライマーダイマーを形成しない配列であることも重要ですが,プライマーがループなどの2次構造を形成しないような配列にすることも重要です.

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すでに回答されてる方の補足をさせていただきます.

(1)プライマーは,目的の遺伝子に特異的に結合しなければいけないので,十分な長さをもつ必要があります.だいたい20塩基前後でデザインして,データベース検索を行い,特異的であることを確認してください.

(2)2つのプライマーの長さは,違っていてもかまわないので,Tmを近づけてください.

(3)3’側の最後の塩基は,GかCがよいとされています(3重結合なのでAやTよりも強い).

(4)プライマーダイマーを形成しない配列であることも重要ですが...続きを読む

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