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酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いて哺乳類の膜タンパクを発現させようとしていますが、うまく発現しません。なんでもいいのでアドバイス下さい、お願いします。ベクターは、GAL1, GAL10を使って、ガラクトースで誘導をかけ発現させようとしています。

A 回答 (4件)

まずはコンストラクションの確認ですよね。



あと株も同じものを使っているのですよね?

やはり何とかしてタンパクの発現を確認するのが最初だと思います。
これらの実験の経験、ラボの状況などを教えていただければもう少し的確なことが言えるかも知れませんが。
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すみませんが,masa23 さんはお書きの様な実験の経験はどの程度お有りでしょうか。他の蛋白では問題なく発現されますか。

私自身は専門外ですが,知人に「H+,K+-ATPase」の研究を行なっている者がいます。彼の話などを聞いていると,お書きの実験は操作はそんなに難しくない(4年生の卒業研究でも行なえる)が,微妙なところにコツがいるようです。

先の回答者へのお礼の中で「論文では同じような条件で」とありますが,同じ条件だと思っているだけで,その微妙な違いが問題なのかも知れません。全く同じ条件ではやれないでしょうか。

もし,蛋白発現の経験があまりないのであれば,面倒でも一つ一つ確認して,どこに問題があるかを明らかにするのが,最初のステップだと思います。

まづ,cDNA はきちんと作れているか,組み込みは行われているか,mRNA はできているか,タンパクはできているか,等々を確認する必要があるでしょう。この辺は,ノ-ザンブロット,サザンブロット,ウエスタンブロット等で確認できると思います。

あまりお役に立たないかも知れませんが,ご参考まで。

 
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この回答へのお礼

丁寧な回答ありがとうございます。
こういう実験は、初めてです。
アドバイスにあるように再度、条件、cDNAなど一つ一つ確認してみます。
ありがとうございました。

お礼日時:2001/06/28 16:22

こんばんわ。


蛋白量自体は得られているか、精製は上手くいっているか、assay系に問題はないかなど、順番に段階を追って検証してみてはいかがでしょうか?あるいは論文と違う条件があるのでしたら、そこを合うように調節してみるとか。具体的なアドバイスにならなくてもうしわけないのですが..。
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この回答へのお礼

再度、回答してくださりありがとうございました。

お礼日時:2001/06/28 16:25

うまく発現しない、というのはどういう意味ですか?


何でチェックして、発現していないのですか?
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます。タンパクの発現を抗体でチェックしたいのですが、抗体をもっていません。そこで、この膜タンパク(Na,K-ATPaseです)
にたいするリガンド(3H-ウアバイン)が結合するかどうか、実験しています。現在のところ発現していると思えるような結果が得られません。論文では同じような条件で的確な結果が得られてるようです。
 
 

お礼日時:2001/06/27 13:43

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