酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いて哺乳類の膜タンパクを発現させようとしていますが、うまく発現しません。なんでもいいのでアドバイス下さい、お願いします。ベクターは、GAL1, GAL10を使って、ガラクトースで誘導をかけ発現させようとしています。

A 回答 (4件)

まずはコンストラクションの確認ですよね。



あと株も同じものを使っているのですよね?

やはり何とかしてタンパクの発現を確認するのが最初だと思います。
これらの実験の経験、ラボの状況などを教えていただければもう少し的確なことが言えるかも知れませんが。
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すみませんが,masa23 さんはお書きの様な実験の経験はどの程度お有りでしょうか。他の蛋白では問題なく発現されますか。

私自身は専門外ですが,知人に「H+,K+-ATPase」の研究を行なっている者がいます。彼の話などを聞いていると,お書きの実験は操作はそんなに難しくない(4年生の卒業研究でも行なえる)が,微妙なところにコツがいるようです。

先の回答者へのお礼の中で「論文では同じような条件で」とありますが,同じ条件だと思っているだけで,その微妙な違いが問題なのかも知れません。全く同じ条件ではやれないでしょうか。

もし,蛋白発現の経験があまりないのであれば,面倒でも一つ一つ確認して,どこに問題があるかを明らかにするのが,最初のステップだと思います。

まづ,cDNA はきちんと作れているか,組み込みは行われているか,mRNA はできているか,タンパクはできているか,等々を確認する必要があるでしょう。この辺は,ノ-ザンブロット,サザンブロット,ウエスタンブロット等で確認できると思います。

あまりお役に立たないかも知れませんが,ご参考まで。

 
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この回答へのお礼

丁寧な回答ありがとうございます。
こういう実験は、初めてです。
アドバイスにあるように再度、条件、cDNAなど一つ一つ確認してみます。
ありがとうございました。

お礼日時:2001/06/28 16:22

こんばんわ。


蛋白量自体は得られているか、精製は上手くいっているか、assay系に問題はないかなど、順番に段階を追って検証してみてはいかがでしょうか?あるいは論文と違う条件があるのでしたら、そこを合うように調節してみるとか。具体的なアドバイスにならなくてもうしわけないのですが..。
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この回答へのお礼

再度、回答してくださりありがとうございました。

お礼日時:2001/06/28 16:25

うまく発現しない、というのはどういう意味ですか?


何でチェックして、発現していないのですか?
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます。タンパクの発現を抗体でチェックしたいのですが、抗体をもっていません。そこで、この膜タンパク(Na,K-ATPaseです)
にたいするリガンド(3H-ウアバイン)が結合するかどうか、実験しています。現在のところ発現していると思えるような結果が得られません。論文では同じような条件で的確な結果が得られてるようです。
 
 

お礼日時:2001/06/27 13:43

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カリウムが多い食品
http://www.big.or.jp/~ryoke/kenko02.htm
http://www.drakahige.com/FAMILY/CHILD/BIRTH/2001/2001092501.shtml

バナナはカリウムが多い果物ですね。
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http://homepage3.nifty.com/takakis2/hayami.htm

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2 酵素を利用する。
 酵素は、タンパク質です。こちらは、食品加工だけでなく、医薬品、化粧品、化学工業品、繊維製品の製造等いろいろな分野で用いられています。
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Qタンパク質発現誘導について

大腸菌を用いての発現誘導の際にpick upしたコロニーを2×YT(+amp)につけovernightし、さらに2×YT(+amp)を加えていて、これは薄めるためにしているらしいのですが、どうして薄めるのでしょうか?

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初めて質問いたします。
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融合タンパク質発現用のプラスミドを作った際に、single colony isolationが不十分だったのではないでしょうか?
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食品中の粗タンパク質含有量を求める際、試料に濃硫酸を加えてアミノ基を加熱分解し、硫酸アンモニウム(弱塩基塩)とした後、強塩基を反応させ弱塩基のアンモニアを遊離させ過剰の硫酸で捕集し、
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>水蒸気蒸留は一般に沸点が高いとか熱により酸化・分解する、水にほとんど溶けないような物質を分離する場合に使われることを考えると、

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QCREB発現ベクター

レポーター遺伝子を用いて転写活性を測定しているのですが、その際にclontech社のp-CMV CREBというプラスミドを同時に過剰発現させています。
しかし、あまり効果が見られず一体どうしたことかと思っております。
何か情報をお持ちの方、または実際に使用されている方の感想などお聞きできればと思っております。

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補足有り難うございます。

>アッセイ系としましてはpGL3 vectorを用いたルシフェラーゼ活性の測定によるもので、細胞はrat-cortical neuronのprimaryです。

なるほどtranfectionの実験系としても、少し難しそうな系ですね。FuGENEとかお使いなんでしょうね。

>CREレポーター(stratagene)も用いたのですが、やはりそれほどの活性上昇は認められず・・・

この系はTATAの最小プロモーターなのでシグナルが弱いことが多いようです。

>フォルスコリンのような活性化剤はある遺伝子での活性上昇は認めていますのでcAMP系のシグナルは働いています。

なるほど。

>少し思うのですが、転写因子の過剰発現というのはどの程度の活性変化が見られるのでしょう。転写因子余剰の場合、シグナルによる活性化(率)というのは相対的に減ってしまうんじゃないかなと最近危惧しています。

Case by caseです。
最近は活性化していない転写因子は、corepressorをrecruitしてしまうという話もありますので、その危惧は正しいともいえます。ドミナントアクティブ体を作製してoverexpreeionさせるしか、その答えは明らかにならないと思います。
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補足有り難うございます。

>アッセイ系としましてはpGL3 vectorを用いたルシフェラーゼ活性の測定によるもので、細胞はrat-cortical neuronのprimaryです。

なるほどtranfectionの実験系としても、少し難しそうな系ですね。FuGENEとかお使いなんでしょうね。

>CREレポーター(stratagene)も用いたのですが、やはりそれほどの活性上昇は認められず・・・

この系はTATAの最小プロモーターなのでシグナルが弱いことが多いようです。

>フォルスコリンのような活性化剤はある遺伝子での活性上昇は認...続きを読む

Q食品中のタンパク質量の求め方

食品中に含まれるタンパク質量を求める方法を探しています。
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> ミクロ法、セミミクロ法の違い
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QpETによる発現ベクターの構築ができない?

本当に困っています。どなたかよろしくお願いいたいます。

pCR4-TOPOに挿入されている遺伝子を制限酵素により切り出し、pET15b及び28aに挿入して発現ベクターを作ろうと思っているのですが、まったくうまくいきません。条件・症状としては以下の通りです。

(1)制限酵素はNdeIとXhoI(SingleとDoubleの両方でやってみたが×、Vectorは分からないがInsertとなるDNAは完全に切れていた、切ったDNAは電気泳動し、ゲル切り出しで精製)
(2)ライゲーションはTOYOBOのLigation Highを使用(16℃で1、3時間とovernight処理を行ったものを使ってみたが×、Vector:Insert比は1:1~1:3で行ったが×、直前にこれを使用して成功しているサンプルがある)
(3)トラホメ用セルはDH5αで行った(セルは購入&自作を使用、ヒートショック・KCM&PEGによる方法で行ったが×)
(4)生えたコロニーをコロニーPCRにかける(培地に問題はなし、インサートが入っている場合のバンドはもちろんのことなぜかセルフライゲーションの場合のバンドも出ない)


文字数の制限があるようなのでとりあえず書いてみました。説明不足名点は補足させていただきたいと思います。よろしくお願いいたします。

本当に困っています。どなたかよろしくお願いいたいます。

pCR4-TOPOに挿入されている遺伝子を制限酵素により切り出し、pET15b及び28aに挿入して発現ベクターを作ろうと思っているのですが、まったくうまくいきません。条件・症状としては以下の通りです。

(1)制限酵素はNdeIとXhoI(SingleとDoubleの両方でやってみたが×、Vectorは分からないがInsertとなるDNAは完全に切れていた、切ったDNAは電気泳動し、ゲル切り出しで精製)
(2)ライゲーションはTOYOBOのLigation Highを使用(16℃で1、3時間とovernigh...続きを読む

Aベストアンサー

>なぜかセルフライゲーションの場合のバンドも出ない

そこまでの文章からすると、生えてきたコロニーがセルフやインサート無しであることもまだ確認できていませんよね。
元のベクターはポジコンとして走らせているのでしょうか。

本当は取れているのに、
コロニーPCRがうまくいっていないだけのような気がします。
(生えているのが全部セルフであるという可能性もありますが)

ミニプレップしてみてはいかがですか。


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