負電荷アミノ酸置換で本当に擬似リン酸化されるのか？

　お世話になっています。疑問に思うことがあるので質問させてください。
　自己リン酸化を行うタンパクのその部位を、負電荷を持つグルタミン酸やアスパラギン酸で置換をしてやると負電荷をもつリン酸化の代わりとなり結果自己リン酸化に近いこととなり、常に活性化されている状態になる…と、とある文献にしるされていました。しかし本当にそのように都合よくなるのでしょうか？明らかにリン酸基とこれらのアミノ酸は構造は違いますし、分子量サイズや電荷の強度に関しても無理があります。ですから凝集などの立体変化が起こり結果失活してしまうのでは…と思いました。
　このことに関して皆さんはどう思われますか？お時間がありましたら是非御意見をお聞かせください。

No.3 回答者： ga111 回答日時： 2007/12/22 19:09

>組み換え体のほうが活性が下がるという結果になりました

そういうことなら、、、

＞明らかにリン酸基とこれらのアミノ酸は構造は違いますし、分子量サイズや電荷の強度に関しても無理があります。

と言われる可能性が高いかもしれません。自分の系に自信があれば、あまり他人のデータに振り回されない方がいいでしょう。また非リン酸化変異が意味があれば、その結果が全体の方向性と矛盾していないか？もヒントになります。

この回答への補足

ご意見ありがとうございます。
　説明を省いていたのですが実はアラニンとイソロイシンでもリコンビナントタンパクを作成しました。活性はWTと比較して確かに下がったのですが負電荷アミノ酸のほうがはるかに下がっていました。ですから凝集が起こったのでないか…と考えています。

補足日時：2007/12/24 03:01

No.2 回答者： tatoo 回答日時： 2007/12/22 18:44

そもそも、どんな論文でどうか書いてあっても、

どんなラボでどういう実験をして確認していても、
自分の実験系で確認するのが普通だと思います。
例えばあるタンパク質はリン酸化して活性化するとAやBやCの活性を持つとして、
その変異体を、ある論文では（１）という実験方法でA活性をミミックするということを確認した上で、その変異体を使って実験をしてたとします。
しかし、自分はA活性を（２）という実験系で見てたいとすればどうでしょうか。
それはあくまで、その変異体を自分の実験で使えるかも、という
「ヒント」を得ただけで、実際（２）実験系で使えるかどうかは
自分でポジティブコントロール実験が必要なのではないでしょうか？

また、その変異体がA活性をもつとあっても、B活性、C活性を持つかどうかということも自分の実験系で調べる必要があると思います。

そういう実験結果は、論文の図にはならないかもしれませんが、
最近はサプリメンタルデータとして求められる思います。

この回答へのお礼

ご意見ありがとうございます。実験操作ひとつとっても考えなくてはいけないことが多くあることが再認識できました。もう一度自分の実験の骨組みについて考えてみたいとおもいます。

お礼日時：2007/12/24 02:52

No.1 回答者： ga111 回答日時： 2007/12/22 10:04

すべてが信用できる論文ではないでしょうが、ある程度は信用できる論文が多いと予想します。

特に、違った方向から確認してある論文。

疑い出したらキリがありませんが、自分でクローンをもらって確認したり、独立の別のラボが同じ置換体を使っていれば、信用できるかもしれません。

ただし、抗リン酸化抗体は構造そのものを認識するようで、擬似置換体を認識しにくいという話をメーカに聞いたことがあります。

この回答へのお礼

ご意見ありがとうございます。
　自分なりにネットや論文で調べてみたのですが、負電荷アミノ酸置換により擬似リン酸化反応が起こりやすいという意見がほとんどでした。
　しかし現在液シンにて確認したところ逆に組み換え体のほうが活性が下がるという結果になりました。担当教官も単独でやってみたところ同じ結果になって矛盾した結果となり、いま考え中です。
　抗リン酸化抗体については初耳でした。貴重な情報ありがとうございます。

お礼日時：2007/12/22 16:19