遺伝子クローニングについて。

Question

インスリンの遺伝子クローニング方法を述べよ。

という問題なのですが、いま一つわからず困っています。
以下自分で考えた解答です。

まずインスリンに関連する膵臓β細胞からｍＲＮＡを分離・精製し、
逆転酵素を用いてｃＤＮＡを作成。ベクターとｃＤＮＡを制限酵素で分解してライゲーションして細菌に組み込む。ｌaｃＺとアンピシリン耐性遺伝子をあらかじめ持たしておき、Ｘ－gaｌ、アンピシリンプレートでコロニーを選別。コロニーをニトロセルロース膜に移して、32Pプローブで標識してオートラジオグラフィー（コロニーハイブリット法）。

なんですが書いていて意味が分からなくなります。
・コロニーハイブリッド法で目的ＤＮＡを含むコロニーがわかったあと
　どうするのか？（コロニーがわかってもインスリン自体の配列はわか　らないのでは？）
・ｃＤＮＡを制限酵素で分解してもすべて同じ断片ができるのだから
　形質転換された菌のコロニーのみがプレートにできても、全てインス　リンの配列を持っているのでは？

と全く根本からわかりません・・・・・
ヴォートやネットを見ても肝心なところがわからず、（おそらくわたしの理解力不足）悩んでいます。

ご教授のほどお願いします。

CTAB · Accepted Answer

でっかい勘違いというか、説明忘れがあったのでまずそれについて。
「・・・ベクターとｃＤＮＡを制限酵素で分解してライゲーションし・・・」とありますが、このときは基本的にベクターとインサートの間を切る意味しかありません。私が制限酵素で切る・・・と言っているのは組み込む前です。つまり、cDNAを作る。そのcDNAをそのまま制限酵素で切る。切った断片をPCRで長さ毎に分ける。一つ一つの断片を回収して精製。ライゲーションを行う。形質転換を行う。ブルーホワイトセレクションを行う。ヒットしたコロニーを回収する。回収した大腸菌を培養して、ベクターを回収。制限酵素でベクターとインサートを分ける。インサートの解析、という流れになります。この場合、インサートはDNAで得られるので、コロニーハイブリではなく、サザンハイブリになりますね、きっと。つまり制限酵素処理はクローニングの前です。前回のわたしの答えは少しそこがこんがらがっていましたね。もうしわけないです。


次に補足についてある程度述べさせていただきます。

まず「つまりできた断片をさらに他の制限酵素で分解→コロニーハイブリ→さらに分解と繰り返していけば、目的の配列を得られるということでしょうか？」ですが、一概にそうとも言えないんですね。目的配列が千切れてしまうかもしれませんから。ただインスリンならおっしゃられている方法で可能なのかもしれません。

インスリンを少し調べたのですが、アミノ酸で30と50残基の複合体みたいですね。これはmRNAだと90と150です。かなり短いですよね。これだとこの90と150の中に制限酵素で切れる部分が存在しない可能性もありますね。その場合はおっしゃられている方法でクローンが作れるということになりそうです。

たとえばインスリンをコードするmRNAが200塩基だとします。mRNA抽出で得られたcDNAが10kbp（100000塩基）だとします。これを制限酵素で切ると100とか200とか500とか1000とか10000とか50000bpとかいろいろとできますよね。このときインスリンをコードする配列を、制限酵素がちょん切っていないならある一つの断片に全コードが入っているはずです。
つまりハイブリしたら1000bpのクローンが当たりだったとした場合、1000bpの断片のインスリンクローンを得たと言えるわけです。そうしたらここでインスリン遺伝子のクローン化は"終了"としてもいいわけです。もし10000bpには入っていたら別の制限酵素でさらに分割して、もっと厳密なクローンを取ろうとしてもいいわけです。
もしインスリンが二つに切れてしまった場合は、おそらくハイブリで二つヒットが出るはずです。そのときは制限酵素を別の物に変えて、もう一度同じ操作を繰り返す事になります。

「インスリンの遺伝子クローニング法を述べよ」についてはインスリン遺伝子を全部コードしたクローンを作れ、ということでしょうから、配列を作る手前まででいいような気もします。配列の解析法まで入ってもまあ大丈夫でしょう。ですから回答の方向性は間違っていないと思います。
クローンというのは同一遺伝子の集合体のことです。つまりPCRでインスリン遺伝子をいきなり増やしても、それはインスリン遺伝子の“PCRクローン”となるわけです。今回はクローニングの方法で述べていますが、その辺を意識しておけばこの問題については的外れなことにはならないかと思います。

思いついたことを書き連ねました。読みにくすぎる気もしますが、どうでしょう？

otx · Answer

ベクターDNAという言葉について狭い範囲でしかご存じないようです。
wikipediaでベクターを調べてみてください。

クローニングとDNA配列を知るということは違うということは理解できましたでしょうか？

＞・コロニーハイブリッド法で目的ＤＮＡを含むコロニーがわかったあと
　どうするのか？（コロニーがわかってもインスリン自体の配列はわからないのでは？）

この疑問はもう解けたということでいいのでしょうか？

cDNAは、質問者様のおっしゃる通りのものです。生物体内において、mRNAはたくさんの種類があります。
その沢山あるmRNAからできたcDNAの中から、目的のcDNAをクローニングしなくてはならないということは想像できますでしょうか？

そういうことなので、以下の文章が何を意味しているのかわかりませんでした。

＞・ｃＤＮＡを制限酵素で分解してもすべて同じ断片ができるのだから
形質転換された菌のコロニーのみがプレートにできても、全てインスリンの配列を持っているのでは？

この文章はどのようなことを示されているのでしょうか？

geneticist12 · Answer

インシュリンは遺伝子のクローニングがかなり初期に行われたもので、その戦略を説明しろということではないでしょうか。文献をあたるといいと思いますが、うろ覚えでなぞると、

まずそれに先立って、インシュリンの分離・精製はかなり古くに確立されていました。タンパク質の構造（前駆体ペプチドがあり、これが二つに切れて互いがSS結合している）、アミノ酸配列もじきに解析されました。

アミノ酸配列がわかれば、それからコドンを推定してオリゴヌクレオチドのプローブを作ることができますね（これがなければハイブリで当たりのクローン取得することはできません）。

あとは、ベータ細胞を集めたり、これを腫瘍化した細胞からインシュリンmRNAが豊富に含まれるmRNAをとって、逆転写でcDNAをつくり、適当なベクターに入れて（当時は岡山・バーグ法でプラスミドに入れたみたいですね）、コロニーハイブリをすれば取れるわけです。薬剤耐性の選別はしているはずですが、おそらく青白選別はしていないと思います（よって、答案には不必要）。cDNAが取れれば、ゲノム上の遺伝子はそれをプローブにしてゲノムライブラリーをスクリーニングすれば（イントロン領域も含め）取れますね。

当然のごとく、遺伝子配列の情報がない段階で遺伝子クローニングするには、スクリーニングに使えるプローブを得るのが問題です。ほかの事例では、単一のタンパク質を専門に作っているような細胞であれば、そこからとったcDNAのほとんど（かなり）がそのタンパク質のものであるはずなので、ランダムに多数とって調べていけば、そのなかに当たりがあるだろうという戦略や、タンパク質が取得できていれば抗体を作って、対象の細胞から目的のペプチドとmRNAの複合体であるポリソームを沈降させて、それからcDNAを取得するとか、あるいは発現ライブラリーから抗体をプローブにしてクローンを取得する方法などがあったと思います。

otx · Answer

「インスリンの遺伝子クローニング法を述べよ」
を
「インスリンの遺伝子配列を知る方法を述べよ」

まったく違います。

クローニングとは、たくさんの種類が混在するDNAなどの中から、
目的の1種類のDNAを単離（クローニング）することです。
配列を調べるのとはまったく違います。

そこが、質問者様が根本的に勘違いをされているのです。


＞・コロニーハイブリッド法で目的ＤＮＡを含むコロニーがわかったあと、どうするのか？

目的DNAを含むコロニーを見つけることが、クローニングの目的なのです。

あと、質問者様は「cDNA」という言葉きちんと理解されているでしょうか？
それと、ベクターDNA、マルチクローニングサイトをご存知でしょうか？

これらのことを知らないので、ちゃんとした作業のイメージがされていないように感じます。

CTAB · Answer

インスリンについてはわからないのですが、クローニングの方面からアドバイスできそうなので少し書きます。

まず「コロニーハイブリッド法で目的ＤＮＡを含むコロニーがわかったあとどうするのか？」については、ベクターに組み込めば、ベクター配列からシーケンスをかけられます。つまり未知の配列でも調べられます。新規の遺伝子を調べる場合はベクターに組み込み、ベクターのプライマーを使って配列を調べるわけです。

つぎに「ｃＤＮＡを制限酵素で分解してもすべて同じ断片ができるのだから・・・」ですが、制限酵素で切ると、長さが色々と違う断片が出来ますよね。それごとにクローニングを行う、ということです。一つの断片からはおっしゃる通り一種類の配列しか得られないのですが、たとえば10kbpを切って、1kbp前後の断片を10個作るとしたら、当然その断片一個一個をクローニングしなければいけませんよね。その10このうち、どの断片にインスリン配列が入っているかをコロニーハイブリで調べるわけです。そうすれば10kbp全部を調べる必要はなくなりますね。ハイブリした1kbpの断片の配列だけを調べればよいということになりますから。

遺伝子クローニングについて。

でっかい勘違いというか、説明忘れがあったのでまずそれについて。

この回答への補足

ベクターDNAという言葉について狭い範囲でしかご存じないようです。

インシュリンは遺伝子のクローニングがかなり初期に行われたもので、その戦略を説明しろということではないでしょうか。

「インスリンの遺伝子クローニング法を述べよ」

この回答への補足

インスリンについてはわからないのですが、クローニングの方面からアドバイスできそうなので少し書きます。

この回答への補足

似たような質問が見つかりました

関連するカテゴリからQ&Aを探す

デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング

マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング