RNAの電気泳動について質問です。

現在、テンプレートのDNA（長さは197bpです。）からT7ポリメラーゼ酵素を用いてRNAを合成し、精製したRNAの長さを電気泳動によって確認するという作業を行っているのですが、予測される目的RNAの長さは132塩基なのですが、実際のバンドは250塩基付近の辺りに単一バンドが出ました。RNAがヘアピン構造を取ると、自身の長さのバンドよりも早く流れるというのは経験済みですが、大きくなったのは始めてです。これは精製したRNA同士で多量体を形成しているおそれがあるという解釈でよろしいのでしょうか？
また、ウチの研究施設には、RNA用のマーカーや試薬がないために、DNAと同様に1×TAEバッファーでアガロースゲルの電気泳動を行いました。マーカーもDNA用のものを用いているので、あまりマーカーは当てにしなくてもいいのでしょうか？
あと、RNAを泳動する際に、1本鎖で流れるようにするテクニックとかありますか？これまでは、RNAを泳動前に95℃で10分ほど熱を加えてから泳動を行っていました。
ヒントでもいいので、ご教授お願いします。

No.4 回答者： w6o6n 回答日時： 2012/12/22 17:39

基本的にNo.3の方の意見に賛成です。

実験の有効性や安全性、ネットの情報の使い方などは、各自の責任の下で確認・判断することです。
前提であり基本なのでわざわざ言いませんけど^-^;


一応補足しておきますが、未変性ゲルでもRNAのサイズ確認は可能です。
Invitrogenのe-gelなどの市販品を始め、私も実証確認の上で使っています。

No.3 回答者： otx 回答日時： 2012/12/22 02:21

ここでの情報をどの程度信頼するのかということ

と、
それを受けた質問者さんがどの程度それを生かすことができるのか。

私はかなり危ないと思っています。

まず、いくらRNAマーカーを買ってもらったところで、
それをきちんとした泳動条件で使用しなければ、
きちんとしたRNAの分子量は、はかれません。

また、RNAをきちんと泳動する条件、ホルマリンを使ったりする場合は、
泳動中、ホルムアルデヒドの刺激臭があたりに立ちこめて、
かなり危険です。

中途半端な知識と情報では、間違った実験の結果を見ることにもなりますし、
実験している人、場所に危険な状況を生みます。

少なくとも、そういうことをきちんと知っている人に
直接、「質問者さんがいる環境（施設、実験室）」ではどう実験すべきか、
それからきちんと指導を受けましょう。

また、羊土社、秀潤社などから、多くの実験書が出版されています。
そのような本は図書館等にもおいてあると思います。

そのようなものからきちんと勉強してはいかがでしょうか？

実験をする我々は、つい忘れがちですが、
我々は危険な薬品等を使って実験をしているのです。
そのような危険を含んでいることを実行しようとしたとき、
（というか、そのような危険を含んでいると常に思うべきです）

ネットで問題を解決しよう、ということは
時に危険です。

頑張ってください。

No.2 回答者： yuklamho 回答日時： 2012/12/19 13:43

No1の方もおっしゃっているようにDNAマーカーを使うことに無理がありますよね。

「RNAを泳動する際に、1本鎖で流れるようにするテクニックとかありますか？」
あまりRNAの経験はないので良く分かりませんが、そんなに気になるのならノーザンする時のゲルとかサンプルバッファーもホルムアミドやホルムアルデヒドの入っているのを使えばどうですか？

合成されたRNAの長さをこの段階でどこまで正確に決めなければいけないのかによって対応も変わってくると思います。

この回答へのお礼

回答サンクスです！

お礼日時：2013/01/04 12:17

No.1 回答者： w6o6n 回答日時： 2012/12/19 02:19

２次構造をとらないものの方がbulkyですので泳動度は低下します。

DNAとRNA、１本鎖と２本鎖では泳動度が異なるので、正確なサイズを求める事はできません。
あてにならないものを指標にしてサイズが正しいか評価するのはどうかと思います。
論文に「得られたRNAはDNAラダーとの比較で多分正しいサイズだと思ったので実験に使用した」と書く訳にいかないでしょう。
RNAマーカーを買ってもらいましょう。
例えば以下のものなら10500円です。
http://www.neb.com/nebecomm/products_Intl/produc …

変性温度は高すぎませんか？
70C,3minの後に急冷で十分ではないでしょうか。
ホルムアミドがあれば、変性の際にダイの替わりに50%(v/v)以上を加えておくと効果的です。


P.S. 完全に蛇足ですが、もし大学院に進学するつもりでしたら、きちんと指導してくれる他大学のラボを受験する事をお勧めします。

この回答へのお礼

色々と御指導ありがとうです！やはり、DNAマーカーでは正確なバンドは分かりませんよね。RNAマーカーを買ってもらいます。

お礼日時：2012/12/19 17:32