No.1
- 回答日時:
一口に、PCR産物のクローニングといっても、いろいろな方法があるのですが、pCRはTAクローニング法のようですので、それを念頭に書きます。
既製品のTAベクターなら、ベクターの問題は無いでしょう。ちゃんとできているTAベクターならセルフライゲーションもほとんど起こりません。コロニーが少なくほとんど青というのは、ごく低頻度におこるセルフライゲーションのみが生えてきたものと思われます。
PCRにつかった酵素は何ですか。TAクローニングをするにはproof-reading活性(まちがって取り込んだヌクレオチを取り除くexonuclease活性)の無い酵素(Taqなど)である必要があります。proof-reading活性のあるPfuやKODなどでは産物を直接使うことはできません。
PCR産物はどのように精製していますか。ゲルから切り出して精製しているなら、UVの当てすぎてDNAが不活性化してしまうことがあります。
もしよかったら、その辺のところもう少し詳しく、どのようにやっているか補足してください。
この回答への補足
お返事ありがとうございます。
PCRに使った酵素はExTaqです。それから、PCR産物は全量10μlで、電気泳動に5μl、残りをそのままライゲーションしています。そこのラボではこの方法のようです。参考書にかいてあるPCR産物の精製はおこなっていないのですが…。
No.2
- 回答日時:
こんにちは。
増幅産物の長さは?
また、バンドはばっちり見えますか?うすいですか?
PCRプロダクトそのままTAライゲーションだと、長いと入りにくいし、量が少ないと入りにくいです。
この場合、50ulの系でPCRして、エタ沈して10ulに溶かし、それの5ul位を使ってみると良いです。ご参考まで。
No.3ベストアンサー
- 回答日時:
同じラボで通常成功しているプロトコールで、難易度も高くなさそうな短いインサートですので、方法論的にこれといった問題はなさそうです。
一つ気になるのは、PCR産物を精製せずにライゲーションするというところです。精製無しでうまくいくとは限りません。むしろそのほうが例外でしょう。副産物やプライマーダイマー、プライマーモノマーが混じっていると意図しないライゲーション産物を生じるので問題です。ゲルからの切り出し、カラムなどで精製すべきです。今回は、はずれのコロニーさえあまりでなかったということなので、別の問題だとは思いますが。一番考えられるのは、経験が浅いということなので、「手」の問題でしょうか。おなじマニュアルにしたがってやっても、新人だとなぜかうまくできないことがあります。でもそのうちに、どこかを変えたわけでもないのに突然できたりします。これはもう、経験を積むしかないです。一度や二度の失敗で音を上げないで、何度でもやり直してください。ベテランと二人並んで、同じ実験をしてもらえる機会があると一番いいのですが。
まあ、新人のうちは失敗して当たり前と思って、繰り返しチャレンジしてください。科学の世界でなんと非科学的な、と思われるかもしれませんが、手技を体得するというのはそういうものです。
ありがとうございます。研修にいっているラボでは精製せずにライゲーションというながれのようです。参考書を読むとPCR産物の精製→ライゲーションとなっていたので、いつ行うのかなと思っていました。
一番は経験不足なのかもしれません。諦めず、繰り返しやっていきたいと思います。
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