全長約6kbのベクターをEcoRI/XbaIで切断し、そこに大体55kbのアダプターをライゲーションしようと試みているのですが、なかなか成功しません。大腸菌のコロニーが生えてこないのです。ベクターのみのトランスフォーメーションでは、コロニーは生えてきませんでしたし、アダプター生成時のアニーリングがまずかったのか、他に原因があるのか分かりかねています。
ベクターはアルフォス処理はしておらず、インサート、つまりアダプターの方にはリン酸基が付加されていないので、理論上繋がることはつながるはずなのですが。
何か解決策が内ものでしょうか?
No.2ベストアンサー
- 回答日時:
もし私がやるとすれば、
(1)ベクターをBAP処理、インサートをリン酸化。
(ベクターが長い程、ベクター同士の分子間反応が起こりやすくなるので、それを防ぐために、ベクターの方を脱リン酸化しておく)
(2)ベクター、インサート共に濃度を落として(ベクター2~3kbpにインサート1kbpを入れる反応と比べて濃度を落とす)、ライゲーションさせる。
(ベクターの一端とインサートの一端がライゲーションされた後で残った末端同士が着く前に、他のベクターやインサートと出会いにくくするため)
(3)ライゲーション反応液を5~10本位に小分けして、それぞれで出来るだけ新鮮なコンピテントセルを形質転換。
(もともと6kbpのベクターは非常に入りにくいので、形質転換効率を少しでも上げるため)
(1)~(3)で目的の形質転換体が得られる可能性が多少は増えます。
ただ、おそらく上記の方法でも一度ではうまく行かないと思いますので、何度かやってみます。
それでもうまく行かなければ、ベクターを真ん中あたりで切るような制限酵素処理をしてベクターA部、B部に分けて、インサートとA部のライゲーション、電気泳動してゲルからの精製(ここではライゲーションに使われなかったインサートが除かれるだけですが)をして、それをB部とライゲーション、形質転換する。
という感じでやってみると思います。
あくまで私がやるとすればのお話です。
参考になればよいのですが。
様々なご助言、ありがとうございました。desertさんが挙げて下さった可能性を考慮して、再度実験を行ってみます。(1)の方法は考えてみたのですが、(2)(3)の方法については思いもよりませんでした。是非、参考にさせて頂きます!
No.3
- 回答日時:
手順自体はセオリー通りだと思います。
つまり、アダプターの分子数をベクターに比べて大過剰にすることによって、ベクターのセルフライゲーションを防ぎ、アダプターーベクターのライゲーション頻度を高める。ただし、アダプターはそれら同士の重合を防ぐために、リン酸化を行わない、ということですね。
アダプターライゲーションは、反応としては非常に容易なものだと思います。むしろ、形質転換のステップを疑いますが。おなじシステムで6-kbかそれ以上のプラスミドで形質転換はうまくいっていますか?
ほかに考えられる原因はやはり、うまくアニーリングしたアダプターが極端に少ないとか、アダプターに質的問題があるのか。。。原理的にアダプターを増やすことで、ライゲーションの効率は上がりますから、思い切ってアダプターを大量に加えることで、多少の質的問題はクリアできるかもしれません。
geneticist12さんには、コンピテントセル作製の際にも質問に答えて頂き、ありがとうございました。この時作製したコンピテントセルを用いて、形質転換を行いました。コンピテントセルの転換効率はおよそ10^7程度で、実験に耐えうると判断しました。
同じシステム系で、同じベクターに5kbのインサートをライゲーションしましたが、この時はコロニーが生えてきました。もしかしたら、コンピテントセルが駄目になりつつあるのかもしれません。アダプターはカスタムオリゴ合成で注文したものですが、グレードが一番低いものなので、アダプターの質的問題は考えられることです。(恥ずかしながら、当研究室、ただいま資金不足でして、あまり高価な代物を購入することができません。)
ご指摘頂いた可能性をもとに、原因を熟考してみます。
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
似たような質問が見つかりました
- 生物学 シャトルベクターの大腸菌への形質転換 1 2022/07/02 23:19
- 楽器・演奏 Digitech Vocalist Live 4 へアダプターの接続について 1 2022/10/15 23:51
- Wi-Fi・無線LAN PCWi-Fiの設定方法がわからなくて困っています。 4 2022/12/28 18:30
- その他(AV機器・カメラ) 遮熱や断熱した金属ウオルボックスはありませんでしょうか。 1 2022/07/09 22:10
- 洗濯・クリーニング・コインランドリー 【 効果ある!? 】工事不要!マイクロバブル発生アダプター 3 2023/04/12 18:09
- Wi-Fi・無線LAN パソコン 無線繋がらない 2 2023/06/30 12:27
- バッテリー・充電器・電池 12V2AのPCで12V3AのACアダプターは使えますか? 5 2023/08/22 10:37
- バイク車検・修理・メンテナンス ネジロック 2 2022/10/14 18:19
- 医師・看護師・助産師 看護学生です。アセスメントの書き方について。 課題でやっている成人看護はヘンダーソン14の項目に沿っ 1 2023/01/20 15:04
- ノートパソコン NEC LaVie Light BL100/T (PC-BL100TA) のバッテリー異常の回復方法 3 2022/04/02 22:13
おすすめ情報
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
おすすめ情報