クロロフィルaの蛍光スペクトル

実験で色素をクロマトグラフィーで分離した後、分離したクロロフィルaの蛍光スペクトルを測定したのですが、660nm辺りのピークの吸光度が0.2(濃度低)になるものを分光蛍光光度計で測定したところ励起スペクトルのピーク付近では異常はなかったのですが、660nm辺りの吸光度が1.8(濃度高)になるものを測定したところ励起スペクトルのピーク付近で放物線がくぼんでしまう(0.2では662nmがピーク波長として検出されたものが1.8の方は662nmがバレー波長として検出され、その前後の655nm,671nmがピーク波長として検出されました)異変が生じました。この異変はなぜ起きるのでしょうか?よろしくお願いします。

No.1 回答者： pome12 回答日時： 2007/07/10 16:59

クロロフィル蛍光と蛍光の再吸収に関する質問と推察します。

ただし，私の読解力が足らないせいかもしれませんが，
吸光スペクトルと励起スペクトルと蛍光スペクトル混同してしまいます。

吸光スペクトルのピークが660nm付近にあるサンプルを用いたのはわかりますが，ある励起波長で励起された蛍光スペクトルのピークについて言っているという解釈でよろしいでしょうか。

そうであれば，励起されたクロロフィルからの蛍光が，周囲のクロロフィルによって再吸収されたことが原因だと思います。クロロフィルの蛍光ピークは吸光のピークと近しい値にあるため(もちろん蛍光の方が長波長ですが)，高濃度サンプルの場合，励起光→吸収→蛍光→再吸収→蛍光→再吸収…の連鎖が起こります。再吸収のされやすさは吸光スペクトルの通りです。

ところで，クロロフィル蛍光は一般に，蛍光ピークを二つ持ちます(685nm付近と730nm付近)。730nm付近の蛍光は再吸収の影響を受けないので，二つのピークを両試験区で比較されると解析のヒントになると思います。

ただし，z0z0z0z0zxさんのおっしゃるような現象は私は見たことがありません。現象を批判的に解釈すれば，以下の検討の余地があるかもしれません。

励起光と検出器の光路が直角となる蛍光光度計では，吸光度の高すぎるサンプルは計測に適しません。励起光がサンプル表面までしか達さないため，検出される蛍光がサンプルの元の蛍光状態を反映していない危険性があるためです。推奨濃度については，マニュアルを良く読まれたらよいかと思います。

この回答へのお礼

大変参考になりました。ありがとうございます。

お礼日時：2007/07/11 02:38