Hisタグをつけたタンパクの精製および濃縮について

もしわかる方がいらっしゃいましたらご教示ください。
私はII型膜蛋白(C末端にHis-Mycタグ有)を動物細胞にて発現させ、Niカラムで精製後、Amicon(MILLIPORE製)を使用して蛋白のBuffer置換および濃縮を行っています。
お聞きしたいのは以下の2点です。
１．カラム操作でWashに使用する0.01%Tween-PBSで蛋白が流れてしまうようなのですが、このようなことってあるのでしょうか？
２．AmiconでBuffer置換および濃縮を行うと、Amicon内で析出しているのか、蛋白の大部分をロスするということがおきています。考えられる原因と、析出させずにBuffer置換(Imidazole→PBS)を行い、5倍程度に濃縮させる方法がありましたらお教えください。

発現量はかなりよく、WesternBlotting・銀染色で確認済みです。
また、精製後も銀染色・Westernで確認していますので、蛋白が存在していることは確かです。濃縮(5mL→1mL)後は蛋白量が1/10くらいになっています。
以前糖鎖の多いI型膜蛋白の発現精製を行った際にも同様にAmiconの操作で大部分をロスするということがありました。そのときは糖鎖が多いせいなのか…ということになりましたが、今回の蛋白は糖鎖が3つほどしかついていなく、特別多いというわけではありません。
同様の実験を行っている人にプロトコルを確認しましたが、やっている手技に間違いはないように思います。
同様の経験をお持ちの方、また知識のある方、いらっしゃいましたらよろしくお願いいたします。

No.1 ベストアンサー 回答者： tatoo 回答日時： 2008/02/06 14:45

タンパク質の精製はタグが付いていても、はっきり申し上げてそのタンパク質の性質次第でいろいろ変わり、方法が一般的なものではうまくいかないことはよくあります。

そういう意味では、１で実際タンパク質が流れているのならば、流れるものなのだと思います。
２についてですが、私はAmiconで濃縮するときにはよく、長時間遠心するのではなく、５分くらいでいったん止め、ピペッティングしてよく溶液を攪拌してまた遠心と、ゆっくりと濃縮しています。
一気に遠心すると、タンパク質は液の下の方（膜付近）でより濃度が高くなり、タンパク質によって濃度が高くなると沈澱する場合がよくあるからです。
または、精製時に少ない量のエリューションバッファーでタンパク質を溶出して、透析でバッファー交換をするだけにすると、
後で濃縮することによる析出が防げるかもしれません。

いずれにしても、そのタンパク質次第ってところあるので、参考までに。

この回答へのお礼

回答いただき、ありがとうございます。
Amiconはいつも20分くらい一気に回していました。
20分遠心→PBSを追加＆ピペッティングで攪拌→再び20分遠心と…。
なるほど、そこまで気を使っていませんでした。
透析でBufferを交換することは以前にも行ったことがあります。
いかんせん、濃度が薄いので量を減らさないと…ということでしたので、ここで相談させていただきました。
Eluteの量を減らすというのも1つの手ですね。

蛋白は確かにモノによるところが大きいです。
一概にコレとは言えないものなんですね。
いろいろ試行錯誤してみます。
ご教示いただき、ありがとうございました。

お礼日時：2008/02/06 15:01

No.2 回答者： tatoo 回答日時： 2008/02/06 15:10

ちなみに、私は透析してバッファーを交換した後、Amiconで濃縮しています。

５分おきにピペッティングをするのに、バッファー交換をしながらやっていたらめんどくさいですので・・・。

この回答へのお礼

2度も回答いただき、ありがとうございます。
確かにBufferを交換しながらやるにはちょっと大変ですね。
結構何回もPBSとか足しては遠心の繰り返しですから。
透析でImidazoleを除いてからAmiconで濃縮という方法を試してみます。
今はまだTransfectしたばかりなので、後日試してみます。
ありがとうございました。

お礼日時：2008/02/08 11:23