タンパク質の巻き戻し確認

今大学の生化学実験で変性タンパク質を巻き戻す実験を行っています。その実験に関連して、タンパク質が変性状態から巻き戻して立体構造を保持していることを解析する手法を挙げろ、という課題が出ました。
タンパク質が巻き戻っていることを確認するだけなのなら、たぶんX線結晶解析やNMRは行わないだろうし、酵素活性の測定は実験で行った方法なので（実験ではリゾチームを巻き戻して溶菌活性を見ました）、それ以外に何かないのかと探しているんですが、見つかりません。もしご存知の方がいれば教えていただきたいです。またそのようなことについて書かれている本があれば教えていただきたいです。

No.3 回答者： yutamadri 回答日時： 2008/11/11 01:25

CDスペクトルや蛍光スペクトルなんかがよく用いられます。

No.2 回答者： mmaro111 回答日時： 2008/11/06 10:05

レポートお疲れ様です。

X線構造解析やNMRでは巻き戻し確認は難しいでしょうね。
分析するためには結晶化する必要があり、これはかなり難しい作業で普通タンパクの構造が壊れます。
いかに、構造を維持したまま結晶化するのか？これが、X線構造解析の鍵です。
NMRでは、解析できるタンパクに制限があり情報も少ないのであまり適さない。


ご自身でもふれていますが、巻き戻し確認（Nativeの状態）をするのは、
調べたいタンパク質のNative機能を確認することです。
リゾチームのように酵素なら、その酵素活性を調べることになります。
接着するタンパク質なら、その接着度。
GFPのような蛍光タンパクならその蛍光度をみる。

おおざっぱですが、変性前のリゾチームと巻き戻し後のリゾチームの溶菌活性を計ることにより、
何パーセントのリゾチームが巻き戻しされたか確認できます。


普通、上記のように確認しますが、今思いついたのは、やや特殊な条件が必要ですが、
たとえば、カラムクロマトグラフィーによる分離。
イオン交換カラムや疎水カラムにかけてみる。通常タンパク質は変性状態とNative状態で目的タンパクの等電点や疎水性が異なるのでこの性質を利用。

また、タンパク質消化に対する抵抗性。
調べたい目的タンパクは、特定のプロテアーゼに対する切断部位がNativeの状態では奥深くに折りたたまれており、切断されないことがある。
変性状態では表面に露出しており、切断されることがある。
特殊な条件ですが、このようなタンパクもあるはず。
その後、SDS-PAGEに切断をよって確認。


もう一個、これもかなり特殊ですが、
タグをつけておくという方法もあるかな？


まあ、普通は活性を測りますよ（笑）

No.1 回答者： dolphino 回答日時： 2008/11/06 01:23

少し、広い視野で考えてください。

この課題は試験ではなくレポートだと思いますので、一つか二つの完璧な答えを答える必要はないと思います。

既に挙げられていることは書いていいでしょう。ただ、ご自身でその欠点を理解しているようなので、それも含めてその手法で分かる範囲と実用性などを述べたらいいのではないでしょうか。

巻き戻しにも程度がありますよね。
巻き戻しで検索してませんか？逆の過程を調べるといいと思います。