ＥＬＩＳＡ

ELISA法で抗原・抗体反応の実験を行ったのですがわからないことが多くて困っています。ひとつでも回答をいただけたら幸いです。

(1)96穴プレートを使用してブロッキングをしたのは抗体がプレートのプラスチックに結合するのを防ぐためと考えていますが、正しいでしょうか？？

(2)吸光度から検量線を作成しましたが、横棒一直線になってしまいましたが、なぜでしょうか？？

(3)同じ抗体の濃度でも吸光度に差がみられたのですが、これは洗浄が均等に行われなかったという解釈で正しいでしょうか？？

(4)もし今度同じ実験をするならどんな点に気をつければ成功するでしょうか？？

どならか詳しい方お願いいたします。

No.4 ベストアンサー 回答者： rio2 回答日時： 2007/05/19 19:00

抗原抗体反応は専門ではありませんが、会社で生物や化学を使って近い仕事しています。

(1) 多くのプレートはPS（ポリスチレン）製で、疎水相互作用で非特異的にタンパクをくっつけてしまいます。そこでブロッキングを行うか特殊コートプレートを用います。

(2) 多くの場合２つの問題が考えられます。ひとつは、バックグラウンドが高すぎて差が見えない。もうひとつは、抗原抗体やバッファーに吸光度検出を阻害するような物質が含まれているかです。吸光度で見たということは、アルカリフォスフェートのような発光系でしょうか？ピアス社のキットのようなものでしょうか？洗浄方法や濃度設定をいじるか、蛍光偏光、SPR、ビアコア、QCM、蛍光系など別の検出方法を試験することも考えてもよいかもしれません。

(3) それも理由のひとつだと考えられます。意外に抗体や抗原濃度をどのようにして算出したかも重要な問題になることもあります。反応時間、反応温度、場所の明暗、抗体の保存状態、結構いろいろなファクターが再現性の要素になると思います。

No.3 回答者： ebikichi 回答日時： 2007/05/17 23:18

詳しい方にお聞きしたいのなら

この情報だけでは不十分です

まずは

１）自作か市販か（自作の場合は抗体の種類、スペックなど）

２）直接法かサンドウィッチ法か

情報が少なすぎてアドバイス出来ないと思います

No.2 回答者： alanami 回答日時： 2007/05/14 14:24

(4)抗体の対象物のポジィティブコントロールを用いて

ELISAの系がしっかり動くことを確認してから、測定したい
サンプルを測定したほうが良いと思います。

No.1 回答者： MIYD 回答日時： 2007/05/14 01:20

直接法でしょうか？

質問文に書かれただけの情報でうまくいかない原因を指摘するのは無理だと思います。

1:
直接法ならばOK
サンドイッチならば△

2:
もともとのプレートの品質か、固層化のステップか、ブロッキングか、検量線を引くためのコントロールか、(あれば)2次抗体の反応か、検出あたりの1つ以上がおかしい
固層化のステップか、検出時の反応条件がおかしいような気がしますが、
書かれている情報からは他のステップの可能性を否定できません。

3:
洗浄がまずくても差が出る可能性があるが、
他のステップでもあり得る
洗浄が均等に行われていない可能性を考えているのに、
固層化やブロッキングや検出が均等に行われていない可能性を無視しているのは何故ですか？

4:
自分で問題点がどこか考えることが出来ないのならば、
出来る人に教わりに行く

目的が、試料中の目的のタンパク質の濃度を知り、その先の実験を進めることではなく、
ELISAの系をネットから得られる情報だけで立ち上げることならば話は別ですが。