ゲル濾過をしようとアマシャムの1×30cm(耐圧0.1MPa)に
Sephadex70を充てんしました。アマシャムのHPLC装置(AKTAFLPC)に接続し、bufferを0.5 ml/minの速度で流したのですが、カラムの限界圧力を超える0.3MPaかかってしまう状態です。0.01ml/minに下げれば、耐圧程度に抑えることが出来るのですが、これだともの凄く時間がかかっていしまいます。
Sephadex 70ってこんなに、超低速で分離しなければならないものでしょうか?
それとも、ゲルの充てんなどがまずかったのでしょうか?
誰か、詳しい方教えて下さい。
No.1ベストアンサー
- 回答日時:
AKTAシステムは使っていました。
ゲルろ過もやったことがあります。
但し、市販のカラムでゲルもSuperdexですが。
もう結構前にやったことなので細かいことは覚えいてませんが
1×30程度のカラムで1時間半位だったと思います。
(一日で準備、分析、洗浄が楽勝でできるくらいですから)
0.01ml/minでは分析だけで50時間もかかってしまいますね。
そんなに遅くはないはずです。
それだと自然落下のゲルろ過より遅い気が・・・
AKTAは高速クロマトグラフィーなのですからもっと速いです。
圧力が上がる原因としてはいろいろありますが
・試料に不純物(不溶物)が多い→試料を遠心して上澄みを使う。
ただのバッファーを流して圧力が高い場合はこれが原因ではないと思いますが。
・ラインのフィルターが汚れている。
本体のフタを開けたところのラインの途中に直径5mm位のフィルターがついています。
これが意外に詰まりやすい。
交換するか超音波ででも洗浄してみてください。
マニュアル(英語)には週1で交換と書いてあった気がします。
さすがにそこまでの頻度では変えませんでしたが割と早く交換してました。
確か1個2,000円と小さいくせに高価だった気がします。
丁寧な返答有り難うございます。
不純物の除去は行っていますので、ラインのフィルターが
汚れている可能性が高いかもしれません。
メンテナンスやってみます。
No.3
- 回答日時:
もう一個思い出しました。
基本的なことで申し訳ないが
バッファーはろ過していますか?
使う前には相当細かい(ポアサイズは失念)濾紙でろ過&脱気が必要です。
私に思いつくのこれくらいですね。
では頑張ってください。
脱気はしましたが、濾過はしていませんでした。
また、サンプルは流さず、bufferによるカラムの平衡化で
このように圧が上がるので、bufferか先のラインのフィルター
の汚れかもしれません。
何度も、有り難うございました。
連休明けにでも、チャレンジしたいと思います。
No.2
- 回答日時:
少し思い出したことがあるので追記します。
他に圧力が上がる要因として
・保存用のエタノール溶液(20%)が残っているときは高い
保存液から水への置換時の流速は半分くらいにした気がします。
でも質問ではすでにバッファーなのでこれは違いますね。
・サンプルの量が多すぎる
サンプルを注入すると多少なりとも圧力が高まります。
イオン交換などは多少(たんぱく質として)多量であってもそこそこの速度で流せますが
ゲルろ過だと許容タンパク量も液量も大変少ないです。
1×30だとたしか200マイクロリットルが液量として最大(タンパクの量は失念)
だった気がします。
もしかするとタンパクの量が多すぎるのかもしれません。
試料がタンパクでない場合は関係ないかもしれませんが溶質が多すぎるのかもしれません。
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
おすすめ情報
- ・漫画をレンタルでお得に読める!
- ・人生のプチ美学を教えてください!!
- ・10秒目をつむったら…
- ・あなたの習慣について教えてください!!
- ・牛、豚、鶏、どれか一つ食べられなくなるとしたら?
- ・【大喜利】【投稿~9/18】 おとぎ話『桃太郎』の知られざるエピソード
- ・街中で見かけて「グッときた人」の思い出
- ・「一気に最後まで読んだ」本、教えて下さい!
- ・幼稚園時代「何組」でしたか?
- ・激凹みから立ち直る方法
- ・1つだけ過去を変えられるとしたら?
- ・【あるあるbot連動企画】あるあるbotに投稿したけど採用されなかったあるある募集
- ・【あるあるbot連動企画】フォロワー20万人のアカウントであなたのあるあるを披露してみませんか?
- ・映画のエンドロール観る派?観ない派?
- ・海外旅行から帰ってきたら、まず何を食べる?
- ・誕生日にもらった意外なもの
- ・天使と悪魔選手権
- ・ちょっと先の未来クイズ第2問
- ・【大喜利】【投稿~9/7】 ロボットの住む世界で流行ってる罰ゲームとは?
- ・推しミネラルウォーターはありますか?
- ・都道府県穴埋めゲーム
- ・この人頭いいなと思ったエピソード
- ・準・究極の選択
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
-
ガスクロ、カラムの空焼きについて
-
カラム容積とは?
-
高速液体クロマトグラフィー(H...
-
粘度の測定について
-
HPLCのカラムのはずし方
-
カラムクロマトグラフィーが苦...
-
TLCスポットが近い時
-
アセトンのGC測定
-
イソクラティックとグラジエント
-
HPLCの洗浄方法について
-
高速液体クロマトグラフィー(HP...
-
容量で "1EA"とはどういう意味...
-
ICP-AESとOESの違いについて
-
ポリエチレンが溶解可能な溶媒...
-
試薬の容量について教えてくだ...
-
メタノールの濃度と比重
-
照明器具の配線(直付け)
-
接点復活材をパソコン内部に使...
-
鹿1級とは、どんな意味がありま...
-
純水って試薬なんですか?
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
おすすめ情報