ベクターに組み込む遺伝子のサイズ

膜蛋白をコードする遺伝子（Igf1r）をクローニングし、リコンビナント蛋白として発現させ、この蛋白に対するモノクローナル抗体を作成したいのですが、目的の蛋白は195個のアミノ酸より構成されています。
ベクターにもよるのでしょうが、どれ位のサイズでベクターに組み込めばよいのでしょうか？

No.4 ベストアンサー 回答者： MIYD 回答日時： 2006/03/31 23:13

まだクローニング出来ていないのでしたら、

モノクロを作るどころの段階ではありません。

ラボにオルソログをクローニングする系があるのでしたら、
一月もかからずに取れるかもしれませんが、
無いのでしたら、
全長をとるのに数ヶ月はかかる可能性があります。
さらに、その上で実際に糖鎖修飾がどこにあるかを調べるのでしたら、
それで1年が終わってしまうかもしれません。

もしくは全長をとらずに、
保存されていそうな領域だけをとる予定なのでしょうか。
(100%を求める先生ならばそれは無いですよね)


ところで、sorutonさんの今の立場は、
その実験の"結果"が卒業や次の職に影響しない立場でいいんですよね。
抗体の場合取れない場合は取れないですし、
(昔、マウスの細胞外にもあるエピトープは取れないか取れにくいと聞いたような‥)
それで卒業や、次の職への推薦書がもらえなくなるのは問題です。

それと、100%を求める先生が、
クローニングで半年~1年、モノクロを作って染めるまでに2年くらいかかり
(昔の先輩が修士２年かけて作ってました)
おそらく数十万円かそれ以上の経費がかかる
仕事を本当に求めているのでしょうか。

数万円で買える市販の抗体でうまく染まれば1,2ヶ月で細胞をソーティングして、
機能解析にいける可能性があります。

イヌ、ネコに交差するかはメーカーが情報を持っていないので、
うまく交渉すれば、サンプルをもらえるかもしれません。
その後で、認識できているというデータ(WBやICCなど)をメーカーに渡せば、
(データシートや宣伝に使われます)
その抗体を1本もらえるかもしれません。

ポリクロならば、抗原があれば、3,4ヶ月で作れるかもしれません。
(出来についてはモノクロと同じく分かりませんが)


ただ、ボスが(時間や経費を理解した上で)本当にモノクロが欲しくて、
sorutonさんが途中の仕事で終わる可能性があるのを理解してやろうとしているのでしたら、
今の方針でいいと思います。

http://www.tmd.ac.jp/med/mmch/Monoclonal%20antib …

No.3 回答者： pi3-kinase 回答日時： 2006/03/31 17:53

おそらく、どの部分を抗原にしたというのは、書いていないと思います。

αサブユニットのN末端部分を抗原に・・・などとしか書かれていないでしょう。抗原は、もちろんFACSに使うのですから、αサブユニットか、βサブユニットの細胞外領域になると思います。
　ただ、IGF1Rは翻訳後、糖鎖修飾を受けているので、その部分は抗原に適さないような気がします(多分、大腸菌などで作製した翻訳後修飾を受けていないものを抗原に用いた場合、実際にイヌやネコでワークするのかが心配。糖鎖に対する抗体も作れるぐらいだから、糖鎖が付いてると抗原抗体反応に支障をきたしそうです・・・)。
　ところで、ヒトとイヌ、ヒトとネコのIGF1Rの相同性ってどうですか？かなりホモロジーは高いと思うのですが、ヒトIGF1Rの抗体は本当に使えないのでしょうか？モノクロ作るのって、かなり大変ですよ！ハイブリドーマで作るっていうことですよね？

この回答への補足

回答ありがとうございます
糖鎖修飾を受けているので、、、、なるほど、そういうことも考慮しないといけないんですね。自分の無知が恐ろしいです。。教えて頂いて感謝です
糖鎖修飾がどうかを知るにはどうやって調べたら分かるのでしょうか？
糖鎖修飾を受ない部分を調べたいのですが

ヒトとイヌでは相同性が88％です。ネコは遺伝子がまだ読まれていないので不明です
モノクロ作成の苦労は聞くのですが　私の研究室の先生はデキル人なので苦労するはずはないという考えだと思います　実験する人は素人の私何ですけどね、、
100％を求める先生なので、イヌ、ネコに対する完璧に近い抗体を作らせたいのだと思います

補足日時：2006/03/31 18:35

No.2 回答者： pi3-kinase 回答日時： 2006/03/31 12:42

αサブユニットは細胞外にあって、βサブユニットの細胞外領域と結合しているのではないでしょうか？つまりαサブユニットは全て細胞外にあって、βサブユニットは細胞外領域、膜貫通領域、細胞内領域があるのではないでしょう？リガンドは細胞外のαサブユニットに結合し、細胞内のβサブユニット中に在るチロシンキナーゼ領域が活性化されて、シグナルが伝わるのではないでしょうか？

　話は変わりますが、モノクローナル抗体の用途は何ですか？免疫染色？イムノブロット？免疫沈降？それとも、その他ですか？ヒトIGF1Rに対するモノクロ抗体なら、コマーシャルであったような・・・。

この回答への補足

獣医領域で使用したいのです
ヒトやマウスの抗体はあるのですが、イヌ、ネコの目的の抗体はないのです　　そこでヒト抗Igf1r抗体がIgf1r（ｍRNAで4989bpと大きいのです！）のどこの部分をターゲットとして作成されているのか知りたいのですが・・・わかりません・・・
だから自分で今設計しようとしているところです

作成できたらイヌ、ネコの血液や骨髄液をFACSをもちいて、CD34陽性でかつIgf1r陽性の細胞（ターゲットは造血幹細胞です）を分離できたらなぁ・・・とかなり実現は困難なことをやろうとしてます

補足日時：2006/03/31 15:10

この回答へのお礼

そ、それから分かりやすい説明ほんとうにどうもありがとうございました
ということは、この蛋白を抗原として抗体を作成したい場合、αサブユニットの一部をターゲットとしたらいいのでしょうか、、、
質問ばかりで申し訳ないのですが、このサイトが今、私の心のよりどころとなっているのでよろしくお願いします

お礼日時：2006/03/31 15:33

No.1 回答者： MIYD 回答日時： 2006/03/31 11:15

(195+1)*3=588bp

で開始メチオニンから終止コドンまで含むことになりますので、
後は両側にクローニングに適した制限酵素サイト
＋制限酵素が切れるために必要な足場数 bp
を足せば
PCRで増幅したフラグメントを制限酵素で切って、
pETなどの発現ベクターに組み込むことが出来ます。
(その後ででもシーケンスを読む必要があると思います)

http://www.kochi-u.ac.jp/~tatataa/tech2/gene/pur …

この回答への補足

またまたありがとうございました
私の研究室の先生は恐ろしくて質問できないので貴重なアドバイス、本当に助かります
もうひとつ質問なんですが、資料によると『αサブユニットは細胞外に存在しリガンドと結合する』
とあるのですが、Swiss-protのデータによると細胞外領域はβサブユニットの領域になっているのですが。。。
これはどう解釈すればよいのでしょうか？？

補足日時：2006/03/31 12:17