分離したPBMCを洗っていくうちに、3×10の7乗個ぐらいの細胞がいなくなってしまいました。おそらくチューブの壁に張り付いてしまっているのだと思うのですが、このような時は、血清を入れないこと、Caを入れないことの他に気をつけるべき点があるのでしょうか?
また、このPBMCから、単球をプラスチックに貼り付けて分離しようと試みましたが、洗っても洗っても単球がはがれてきません。な、なぜ、、、
EDTAを加えたり、洗浄用のバッファーを冷やしたりしましたが、一向にはがれる様子がありません。
激しくフラスコをシェイクし,やっとのことではがせましたが、洗浄するとこれまた細胞一個たりとものこっていません。
10mlの血液から始めて、フィコールでPBMCを分離した時はたくさん細胞が取れたのに、洗ったり、分離したりしてるうちに最後には跡形もなく消えてしまうのです。
どなたかお助けください。
No.2ベストアンサー
- 回答日時:
No.1です。
投稿がとぎれてしまいまいた。申し訳ありません。一般的なヒト単球分離方法ですが・・
1 PBMC 1~2×10の7乗個ほどをRPMI1640培地
(FCS10%加)に浮遊
培養フラスコにヒト非働化血清1mL加え培養面にな じませ4℃で30分以上放置する
滅菌PBSを0.2%EDTA-Na 5%FCSに調製し4℃保存
2 血清処理フラスコに細胞浮遊液を加え、37度 1
h CO2インキュベーターで培養
3 培養フラスコを振とうして、液を捨てる。(2回洗
浄を繰り返す)
4 滅菌PBS(キレート剤添加済み)5mLを加え4℃ 30分
5 冷却培養液で2回洗浄、液を回収。
以上が一般的な接着法による単球の分離です。
洗っていくうちにPBMCがチューブの壁にくっつくといったことは経験上ありませんでしたが、洗浄後の遠心時に底にペレットは見えていますか?
見えているのなら上清を捨てる際にデカントで捨てていませんか?
単球の分離の際に細胞を顕微鏡で観察していますか?
以上の点・及びプロトコールの違いがあれば教えてください。
丁寧にご回答いただき恐悦至極に存じます。
洗浄後にきれいなペレットにはならず、バキュームで慎重に上澄みを除いた後、タッピングすると少し液がにごる、といった感じです。1.5mlチューブにて遠心すると、細胞がベターっと壁にへばりついて、なかなか落ちません。
ひょっとしたら洗浄メジウムやPBSに血清を添加しないといけないのかもしれませんね。
教えていただいたプロトコールでもう一度トライしてみようと思います。
単球分離の際、細胞を顕微鏡で見ますと、形が「張り付いてますよー」って感じになって、のっぺりとしているのが分かります。トリプシンーEDTA使用時の様に、細胞が丸くなったりとかはしていません。何度洗おうが、しっかりくっついています。
使っているメジウムはCa無添加なので、キレートはいらないかなと思っていたのですが、一度お教え通り添加してみます。
ありがとうございました。
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