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分離したPBMCを洗っていくうちに、3×10の7乗個ぐらいの細胞がいなくなってしまいました。おそらくチューブの壁に張り付いてしまっているのだと思うのですが、このような時は、血清を入れないこと、Caを入れないことの他に気をつけるべき点があるのでしょうか?

また、このPBMCから、単球をプラスチックに貼り付けて分離しようと試みましたが、洗っても洗っても単球がはがれてきません。な、なぜ、、、
EDTAを加えたり、洗浄用のバッファーを冷やしたりしましたが、一向にはがれる様子がありません。
激しくフラスコをシェイクし,やっとのことではがせましたが、洗浄するとこれまた細胞一個たりとものこっていません。

10mlの血液から始めて、フィコールでPBMCを分離した時はたくさん細胞が取れたのに、洗ったり、分離したりしてるうちに最後には跡形もなく消えてしまうのです。

どなたかお助けください。

A 回答 (2件)

No.1です。

投稿がとぎれてしまいまいた。申し訳ありません。
一般的なヒト単球分離方法ですが・・
1 PBMC 1~2×10の7乗個ほどをRPMI1640培地  
  (FCS10%加)に浮遊
  培養フラスコにヒト非働化血清1mL加え培養面にな  じませ4℃で30分以上放置する
  滅菌PBSを0.2%EDTA-Na 5%FCSに調製し4℃保存
  
2 血清処理フラスコに細胞浮遊液を加え、37度 1
  h CO2インキュベーターで培養
3 培養フラスコを振とうして、液を捨てる。(2回洗
  浄を繰り返す)
4 滅菌PBS(キレート剤添加済み)5mLを加え4℃ 30分 
5 冷却培養液で2回洗浄、液を回収。

以上が一般的な接着法による単球の分離です。

洗っていくうちにPBMCがチューブの壁にくっつくといったことは経験上ありませんでしたが、洗浄後の遠心時に底にペレットは見えていますか?
見えているのなら上清を捨てる際にデカントで捨てていませんか?

単球の分離の際に細胞を顕微鏡で観察していますか?

以上の点・及びプロトコールの違いがあれば教えてください。
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この回答へのお礼

丁寧にご回答いただき恐悦至極に存じます。

洗浄後にきれいなペレットにはならず、バキュームで慎重に上澄みを除いた後、タッピングすると少し液がにごる、といった感じです。1.5mlチューブにて遠心すると、細胞がベターっと壁にへばりついて、なかなか落ちません。

ひょっとしたら洗浄メジウムやPBSに血清を添加しないといけないのかもしれませんね。
教えていただいたプロトコールでもう一度トライしてみようと思います。

単球分離の際、細胞を顕微鏡で見ますと、形が「張り付いてますよー」って感じになって、のっぺりとしているのが分かります。トリプシンーEDTA使用時の様に、細胞が丸くなったりとかはしていません。何度洗おうが、しっかりくっついています。

使っているメジウムはCa無添加なので、キレートはいらないかなと思っていたのですが、一度お教え通り添加してみます。

ありがとうございました。

お礼日時:2006/04/25 17:29

同じくフィコールを用いてPBMCを分離しているものです。



PBMCから単球の分離はどのように行っておられますか?
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