形質転換について

アグロを用いて植物の形質転換を行おうと思っています。植物体に存在する遺伝子を導入し過剰発現、もしくはアンチセンスにより発現抑制を行って、その遺伝子の機能を見ることを目的としています。そこで疑問があります。アグロより植物体に導入遺伝子が挿入されるということですが、実際植物体のゲノムのどの位置に挿入されるかはランダムなのでしょうか？ランダムだと導入遺伝子以外の遺伝子を分断させてしまったり、コドンがずれたりしてしまって、形質転換後の植物体の変化が目的遺伝子によるものだといえなく形質転換の意味があまりなくなってしまう気がしますがどうなのでしょうか？

No.1 ベストアンサー 回答者： miya_0726 回答日時： 2007/03/19 11:50

アグロは使ってはいないのですが・・・。

アグロによる形質転換を行うと、T-DNA領域部分が植物のゲノムDNAにランダムに挿入されます。これは間違いありません。なので、挿入位置がたまたま遺伝子領域があったらその遺伝子はDisruptされますし、せっかく挿入した配列から転写がおこらなかったり転写されても蛋白が翻訳されなかったりも当然あります。

そのため、形質転換実験を行う際には、形質転換クローンを多数取得した上で、
・導入したい遺伝子と共に薬剤耐性遺伝子を入れておき、薬剤耐性による選抜
・ゲノム内に挿入されている領域を特定し、PCRによる増幅、シーケンスによる塩基配列確認
・リアルタイムPCR、ノーザンブロッティングによる転写（量）確認
・ウェスタンブロッティングによる翻訳（量）確認
などを行い、導入した配列から正しく発現がされているかどうかチェックする必要があります。

ランダムに挿入されるから発現しないかも、ではなく、ランダムに挿入されるのでその中で他に影響が少なそうなものを選ぶ、という考え方なのです。

この回答へのお礼

丁寧なご回答ありがとうございます。多数のクローンからうまくいったクローンを選ぶという考え方なのですね。理解しました。
挿入された配列が正しく挿入、発現されているかどうか確認する必要があることとそのやり方もわかりました。

初心者で申し訳ないのですが、さらに質問させてください。植物体が持っていない遺伝子を導入する場合はすぐ導入位置と発現を確認できそうですが、過剰発現やアンチセンスの場合は導入位置、発現等は具体的にどう確認すればいいのでしょうか？発現量が多いとか少ないとかで判断すればいいのでしょうか？

お礼日時：2007/03/20 01:13

No.3 回答者： miya_0726 回答日時： 2007/03/22 09:31

No.1と2です

もちろん、プロモーターを繋いでいなければ発現しないと思います。
・・・というのは理論上の話で、実際には隣に配置した薬剤耐性遺伝子のリードスルーで転写が起こったり、T-DNAが組み込まれた領域がたまたま転写されている領域だったり、たまたまプロモーターライクな配列が上流にあったりして転写が起こる例はあるみたいです。
ただしこれらの理由による発現量はそれほど多くないと思われますので、リアルタイムPCR、ノーザンブロッティング、サザンブロッティングなどで量を確認できるほど発現させるならプロモーターを接続すべきでしょう。
私は植物の方に明るくは無いので、プロモーターデータベースがあるかどうかについてはお答えできません。ただ、Arabidopssisであればゲノム解読も終わっていますし、DNAマイクロアレイ解析やcDNA解析なども進んでいますので、期待する器官やステージに特異的な発現を示す内在遺伝子を探し出すことができればその遺伝子のプロモーターを持ってくることで目的は達成できると思います。

この回答へのお礼

ありがとうございました！とてもよくわかりました。

お礼日時：2007/03/26 12:33

No.2 回答者： miya_0726 回答日時： 2007/03/20 12:42

No.1です

>過剰発現やアンチセンスの場合は導入位置、発現等は具体的にどう
>確認すればいいのでしょうか？発現量が多いとか少ないとかで判断
>すればいいのでしょうか？

例えば、導入する配列に薬剤耐性遺伝子が入っていればそれを手がかりにPCRやシーケンスで特定もできますし、導入遺伝子ならばHisタグその他のタグ配列をつけておけばそれも目印になります。そもそもT-DNAの両端の配列は植物にはほとんどない配列なので、これ自体が目印になるのかな？と思います。（T-DNAについてはちょっと自信ないです）
ナチュラルな状態で発現させるのであれば、何もしていない細胞と比較して対象遺伝子の発現量が増えた減ったで判断すればよいですね。必ず別のハウスキーピング遺伝子（動物細胞だとGAPDHが多いです）を使って、「このハウスキーピング遺伝子の発現量は変わらないが、対象遺伝子の発現量は変わった」としないと説得力ないですが・・・。
タグ付けたらそのタグを認識する抗体を使ってウェスタンブロッティングもできます。これなら内在の遺伝子と区別もできます。

この回答へのお礼

ありがとうございます。とてもわかりやすく理解できました！タグ配列をつけることも考慮に入れたいと思います。

・・・別の話題になってしまうのですが、形質転換関係で気になったことがあるので質問させてください。導入遺伝子につなぐプロモーターの話です。仮にプロモーターをつながなかった場合、適切な位置に遺伝子が挿入されたとしても、発現されないままなのでしょうか？器官やステージ特異的に遺伝子を発現させたい場合、適切なプロモーターを選ぶ必要があると思いますが、プロモーターのデータベース等は存在しているのでしょうか？

お礼日時：2007/03/21 20:10