タンパク質実験について

タンパク質の基礎実験を行った際に、後日以下のような課題が出ました。

1.タンパク質の定量では1つの粗画分についての3つの異なる容量を用いて
　定量を行うのはなぜか。
2.タンパク質の定量で検量線を作成するのに用いた標品タンパク質の
　名称を明記する必要があるのはなぜか。
3.調整した粗画分中に目的の酵素（アルカリホスファターゼ等）が
　存在するかどうかを調べる方法について考察せよ。

内容的には非常に簡単な内容だとは思うのですが、
逆に単純な問題過ぎて私の浅い知識では粗末なものしか出来あがりませんでした。
また、様々な文献もあたってみましたが参考になるようなものは見当たりませんでした。
どなたかこの問題に的確な答えがわかる方、もしくは、参考になるようなページを御存知の方、
いらっしゃいましたらどうか教えて頂けないでしょうか。
お願いします。

No.5 回答者： Hi104 回答日時： 2002/10/01 15:04

学生実験の立場でお答えします。

（１）３点測定する理由は単純です。１点ではなんだかわからない。２点では直線を引けるが、誤差があるかどうかはわからない。３点なら、その誤差もある程度わかる、からです。研究と異なり、学生実験では結果がわかっているので、３点取れば十分です。

（２）タンパク質の定量といっても、実は実験材料のタンパク質量を測定しているのではないのです。指標とする標品タンパク質に換算しての「タンパク質量」なのです。だから、検量線作成に使用したタンパク質の由来が明確でないと、測定したタンパク質量も明確でないということになります。

（３）目的のタンパク質が酵素なら、その酵素活性を調べるのが常套手段です。そういった特徴がないなら、抗体をつかって反応量をみます。精製段階を上げていき、それに伴い、反応量が増加すれば、精製されたことになります。応用編として、遠心分離器で分画して、それぞれの画分について反応量を調べることで、目的のタンパク質が可溶性かどうか、またその局在性もある程度までは見当をつけることができます。

No.4 回答者： ryumu 回答日時： 2002/09/30 01:02

久々に回答をしています。

他の方達も答えられてるので、補足的に・・・

1・・・これは定量時に試料の用いる量、ということでしょうかね？

濃度が高すぎる場合のことと、あと、定量の誤差を調べる意味合いもあると思います。
そういう意味では、”少なくとも”三点は取るべきでしょう。
しかし、三点に限定されるものではないとおもいます。

２・・・これは、例えば二種類の”同じ重量”の蛋白を定量した場合、定量法によっては、異なる値を示すことがあるからです。
普通、絶対的な重量が必要ない場合は、”どんな方法”で、”何を基準”にして定量したか・・・ということを明記しておけば、実験の再現ができるはずです。


３・・・ウェスタン、活性測定etc


実際に実験をすることで、やっと分かる・・ってこと、結構ありますよね＾＾；

No.3 回答者： kgu-2 回答日時： 2002/09/29 03:13

>内容的には非常に簡単な内容だとは思うのですが、

学生時代に、生化学の教授が、「タンパク質が測定できたら、一人前」と話されました。そのときは意味が分かりませんでした。タンパク質はいろいろな種類があるので、そのタンパクに適した測定法を選べるようになったら
一人前、と今では解釈しています。
　例えば、私の研究しているメタロチオネインは、61個のアミノ酸ですが(ポリペプチドというべきかも、だがタンパクで通用している)、280nmに極大吸収が無く、吸光度で測定するのは困難です。

1　については、意味が分かりません。容量というのが、検量線をオーバーするのに備えて、実際には3種の濃度ということなら、私は「間違っている」と回答します。私は、オーバーした時点で、希釈(吸光度計を使うなら、必ず、まず、10倍、次は100倍、1000倍、10000倍・・とする。これ以外は誤り)して測定します。
　逆に質問すると、3つの根拠はなんなのでしょうか。10くらいの容量の方が、あるいはもっと数を増やした方が良いのでは、と質問したいくらいです。経験的には、希釈を3段階ですれば、ほとんどの場合OKですが、私は10000倍に希釈して、検量線の中に入った経験があります。ですから、3つというのは、根拠が薄弱で、非科学的です。
ただ、状況に応じて、10倍、100倍、1000倍希釈のものも用意することはあります(経験上の判断で、科学的な説明は困難です)。

2　これは、吸光度が、タンパクによって異なるからです。280nmだけではなく、微量の測定法であるフォーリン・ローリー法でもタンパクによって大きく異なります。比較的一定なのがピューレット法です。ですから、単に名称を記すだけではなく、そのタンパクとアミノ酸組成が似たもので検量線を作製する必要があります。
　検量線といえば、検量線を2連つくってその平均で検量線を作製する、というバカな指導もあるようです。その方が正確なものが出来るからでとか。それなら、2連でなく、3連、5連、10連・・の方が正確だと思うのですが。

3　これは、酵素の反応を利用する、のが第一です。酵素反応も、直接測定する場合と、感度の良いNADHの反応を含む酵素反応を組み合わせることも可能かと。
　抗体が利用できるのなら、それもお勧めです。

No.2 回答者： rei00 回答日時： 2002/09/27 16:25

　大学生の方でしょうか。

タンパク質実験に関する多数の成書が存在しますので，図書館ででも行ってそれらを御覧になる方が確かだと思いますが・・・。

　私の想像を簡単に。

【１】
　測定試料中に含まれるタンパク質の量は通常不明です。通常，吸光度測定には適した濃度範囲が存在しますので，容量が１つだとタンパク量が多すぎたり少なすぎたりして，その濃度範囲に入らない可能性が出てきます。「3つの異なる容量」で測定すれば，そうなる可能性を減らす事ができます。

【２】
　タンパク質と一括りで言っていますが，個々のタンパク質によってモル吸光係数は異なります。そのため，標品タンパク質を明記しないと他のデータとの比較ができなくなります。

【３】
　どのレベルでの話でしょうか。簡単には，その酵素に対する選択的な基質を用いて酵素反応を行なってみれば良いはずです。

　反応が進めば，その酵素が存在する事になりますし，どの程度進むかで酵素の量を知る事もできるはずです。

No.1 回答者： arupa5 回答日時： 2002/09/27 13:04

すいません。

要点を少し抜かしてしまいましたので、友人のIDから失礼します。
実験の内容は
「大腸菌を使って、吸光度でタンパク質の定量を行う」
という実験でした。
それでは、ご教授お願いします。