A 回答 (2件)
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No.2
- 回答日時:
>pETベクターにはそもそも遺伝子が入りにくいものなんでしょうか。
そんなことはありません。
あと、うまくいかない理由で考えられることは山ほどありますが
他の理由を考えたほうがいいと思います。
No.1
- 回答日時:
ほかのベクターに比べて入りにくい(ligationしにくい)ということはないですが、大腸菌に入れたときに大腸菌が増えにくいということはあります。
そのためにコロニーが生えてこないのではないでしょうか。大腸菌が増えにくいのは、外来遺伝子からタンパク質が発現してしまい、それが大腸菌にたいして毒性を示すことがあるからです。
宿主菌はなにを使っていますか? 大量発現の時に使うBL21(DE3)だと誘導をかけなくてもleakyに発現して、大腸菌が死んでしまうことがあるのでサブクローニングには不適です。まず、DH5などpET15からの発現に必要な遺伝子(T7 polymerase)を持たない系統でサブクローニングして、当たりのプラスミドを精製してBL21(DE3)に入れなおすといいでしょう。
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