ALDH2(アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ2)を持つ人(Normal)と持たない人(Mutant)を判定する実験を行っています。
NormalとMutantは1塩基多型であり、Normal用プライマーとMutant用プライマーの両方でPCRを行い、どちらのプライマーで増幅が起こるかによって遺伝子型を判定しています。
この実験のプロトコルがニッポンジーンのホームページ上にあるのですが、用いるプライマー(Reverse)の塩基配列を調べたところ、
Forward : 5'-CAA ATT ACA GGG TCA ACT GCT-3'
Reverse-Normal : 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT C-3'
Reverse-Mutant : 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT T-3'
となっています。
ところが、Reverseが結合する部分のDNAの塩基配列は
Normal:3'-GGT GTG AGT GTC AAA AGT GAA G-5'
Mutant:3'-GGT GTG AGT GTC AAA AGT GAA A-5'
↑
であり、↑部の塩基「T」はReverseとはミスマッチになっています。Reverseのこれに対応する部分は「A」になるべきではないでしょうか?
不思議に思い、早速、ニッポンジーンに問い合わせたのですが、ニッポンジーンではT.Takeshita(1994)の論文を参考にしており、ミスマッチ部の「T」を「A」にしてPCRを行ったデータは持っていないとのことでした。
このプライマー設計にはどのような意図があるのでしょうか?
No.1ベストアンサー
- 回答日時:
参考URL、Methodsの第一段落に書かれていますが、
プライマーは5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT
をつかっていて、
件の位置にmutationを入れることで、ALDH2が正常な人ではCTCTTCという制限酵素Ksp632Iの認識配列ができます。
増幅断片がKsp632Iで切れるか切れないかで判定していたようです。
ニッポンジーンのプロトコルはそれの名残ではないでしょうか。
参考URL:http://ehp.niehs.nih.gov/members/1996/Suppl-3/56 …
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