PCRでバンドが2,3本出てしまいます。

18SrDNAの約2000bpを増幅するプライマーを使ってPCRをしています。バンド2000bp付近に1本だけでて欲しいのですが、今日久しぶりにやってみたら2000bp付近に2本出たり3本出たり全く出なかったりしました（ポジティブコントロールも凄く薄かったです）。以前はすべてのサンプルで2000bp付近に1本だけはっきりと出たのですが、今回失敗してしまった原因にはどんなことが考えられるのでしょうか？2000bp付近に1本だけはっきりと出た以前のPCRでは間違ってプライマーの濃度を３倍くらいにしていたのですが関係あるのでしょうか？他の条件はすべて同じです。

No.1 ベストアンサー 回答者： robita 回答日時： 2004/04/13 06:05

ren-ishizakiさん、こんにちは。

もう少し、発想を柔軟にしたほうがよろしいかと。

ren-ishizakiさんが
＞2000bp付近に1本だけはっきりと出た以前のPCRでは間違ってプライマーの濃度を３倍くらいにしていたのですが関係あるのでしょうか？他の条件はすべて同じです。
と考えているのでしたら、今回の条件と前回の条件で比較してみたらどうですか？PCRなんて試薬混ぜるのにも30分もかからないし、あとはサイクラーに任せるだけ。電気泳動の手間を考えても手を動かすのは1時間ほどでしょう？試薬も今は安いのですから。

あと
＞間違ってプライマーの濃度を３倍くらいに
とありますが、これはメーカー推奨濃度の3倍なのでしょうか？PCRはうまくいく条件であれば推奨濃度と違っていても「間違い」ではないですよ。論文でも推奨濃度の2倍量で行っているものも見かけるし、自分でも場合によってはdNTP濃度やMg濃度を変えてPCRを行うこともあります。

一般的にプライマー濃度が増えればターゲットの増幅が良くなる反面ノンスペが増えるようです。（ただ、これは一般論で昔プライマー濃度をあげたらノンスペが減った経験が自分にもあります。）

ささいなことで悩まれるよりも手を動かしてみてください。

No.3 回答者： noname#7004 回答日時： 2004/04/15 15:29

非特異的なバンドが多いときには

アニーリング温度を2度ほど上げると一般的にはいわれていますね。
サーマルサイクラーは結構デリケートでコンセントを抜いたり刺したりを繰り返すと、1度ほど温度がずれる事もあると聞きます（経験しました）。
また、低融点アガロースゲルで切り出す事も可能なんじゃないですか？
とりあえず色々試してみましょうよ。

No.2 回答者： takumicchi 回答日時： 2004/04/14 01:47

以前とまったく同じテンプレートを同じプライマーで増やすなら、以前とまったく同じ条件にしてみては?原因を追究するのはそれで上手くいかなかったらでも遅くはないでしょう。

それから、テンプレートの濃度や保存状態、プライマーのTm等、もっと詳しい情報を出さなければ適切なアドバイスのしようがありません。