DNA断片分析のPCR法で使うMasterMixについて

Question

PCR法を用いて、DNA分析をしました。

手順に、MasterMixを調製する際、必ず氷などで冷やすようにと注意書きがありました。これは何故なのですか？温度ですぐダメになってしまうのでしょうか？なぜ冷やす必要があるのでしょうか？

あと、調製の際、contaminationにも気をつけるようにと注意を受けました。なぜ、そんなに簡単にcontaminationが起きてしまうのですか？

まだ勉強不足なのは承知です。基本的なことを教えて頂ければ幸いです。

宜しくお願いします。

MIYD · Accepted Answer

>氷上
酵素やdNTPはそれほど不安定ではありませんが、
室温で行うと、適当にアニールしたプライマーでpolymeraseが伸長反応を行う恐れがありますので、氷上で操作します。

>contamination
どのくらい気をつけるように言われたのかと、簡単をどの程度と考えているのか分かりませんが、
PCRは例えば20サイクル回した場合、100万倍位にテンプレートが増幅されます。
そのため、コンタミしたものも、条件さえ合えば100万倍位に増幅されます。

noname#160718 · Answer

私は「氷上での操作」はあまりシビアにはしていません。せいぜい試薬のチューブを氷冷している程度です。
(クラッシュアイス上に置くか氷冷ラックを使うか)
　理由は他の方が書かれているとおりで、私はホットスタート用のTaqを使っているので、室温でTaqが動いてしまうことも基本的にはありませんから。
　チューブやプレートを冷やして作業することに気を取られるより、作業のみに集中して一気にやってしまった方が、良い結果が出ます。

　コンタミに関しては、まあ一度修羅場(?)を経験するまでは、なかなか自分に対してシビアにはなれないだろうな、と思います。私もそうでしたから。
　遺伝子を検出してしまったら即座に記者会見が開かれて世間がパニックに陥る・・・というようなＰＣＲをしていると、嫌でも自分をとことん客観的にチェックする習慣を持たないと危険ですが・・・

　それが研究のためのPCRで、コンタミしても「ありゃ、やり直しか」で済むようなPCRだと、ネガコンが反応してしまって96穴プレートをフルに使ってやったPCRが×、という精神的にも経費的にも痛い目に遭えば、気をつけるようになるのですが・・・
　PCRでひたすら産物を確保してそれをシークエンスして解析を・・・というようなPCRでは、ほとんどの検体に目的遺伝子が存在しているわけで、コンタミも起きやすいです。というか、コンタミとの戦いになることも多々あります。

　フィルター付きチップを使えば、確かにコンタミのリスクは幾分減らせますが、RT-PCRやNested-PCR等の「何度もチューブやプレートの蓋を開けてサンプルを取る」ようなPCRは、それでもコンタミします。
　コンタミも単なるサンプル間コンタミのうちは良いのですが(やり直せば済む)、試薬や水に入ってしまうとかなり厄介です。「何にコンタミしたのか」を突き止めるのに多大な労力と経費を必要としますから。

　コンタミ対策として、私はほとんど全ての試薬類をだいたい20検体分くらいに小分けしてストックしています。水とバッファは0.5～1mlくらいずつ分注して凍らせていますし、プライマーやプローブは作業の一番最初に使う分だけ小分けしています。
　で、基本的に小分けしたチューブは使い切りで、余っても捨てる、ということをしています。TaqやRTだけはそういうわけにはいかないですが・・・

　それと、電気泳動は非常にリスキーなコンタミ源です。あのバッファには極めて高濃度なDNAがうようよしてますから。
　なのでPCRをする部屋と電気泳動する部屋は分けたいところなのですが、そういうわけにもいかないので、せめて区画を明確に分けています。

　何回か修羅場を踏んだ経験からの知恵、なのですが・・・

geneticist12 · Answer

ほかの方のかかれていることに加え、校正活性（proof-reading）のある酵素を使う場合、反応液調製中に一本鎖に対するexonuclease活性が働いてプライマーが分解されてしまうのを防ぐために冷やしておくという意味もあります。
普通のTaq polymeraseだと校正活性がないのであまり関係ないですが。

tatoo · Answer

PCRに使用する溶液や物質は、それほど室温で不安定なものはありません。
しかし、分子生物学の実験において、冷やしておいて悪いことがないので（特別な場合を除いて）、よく冷やしておきます。

ただ、PCRにおいては冷やしておく最大の理由があります。

それはTaqポリメラーゼの活性を反応開始まで抑えるという理由です。
No１さんがご指摘の通り、室温ではPrimerが非特異にDNAに結合します。
その時、室温だと、弱いですがTaqポリメラーゼが活性を持ち（至適温度は約70度で、40～50度では20%程度の活性を持つらしいです）、
非特異的に増幅したDNAができてしまって、それを鋳型として機械に入れて実際の反応を始めた場合、非特異的なものを検出することになり兼ねないからです。

コンタミに関してですが、PCR用に綿が詰められたチップ（ピペットマンに付けるやつです）が売ってあり、気にする人は使います。
それは空気中に浮遊しているものや、他の人が誤ってピペットマンで吸ってしまったものをピペッティングの際にチューブに入らないようにするためです。
このくらい気を付ける人は神経質にするほどコンタミるときはします。

DNA断片分析のPCR法で使うMasterMixについて

>氷上

私は「氷上での操作」はあまりシビアにはしていません。

PCRに使用する溶液や物質は、それほど室温で不安定なものはありません。

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